發(fā)布時間：2020-06-16 07:16

【摘要】：青蝦,學(xué)名日本沼蝦(Macmbrachium nipponense),隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda),長臂蝦科(Palaemonidae),沼蝦屬(Macrobrachium),主要分布在中國、日本、朝鮮半島和越南北部等國家的淡水水域。青蝦具有生長快、繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟(jì)價值高等特點,是我國淡水養(yǎng)殖的主要品種之一。近年來青蝦相關(guān)重要功能基因被廣泛研究,同時也是本實驗室的科研重點。目前本實驗室已對與生殖、生長和性別相關(guān)的GIH、Vg、VgR、IAG等近20個功能基因進(jìn)行了系統(tǒng)的科學(xué)研究。已報道,蛻皮啟動激素受體(Ecdysistriggering hormone receptor,ETHR)在昆蟲蛻皮過程中發(fā)揮重要作用,生殖母細(xì)胞特有因子1(Gametocyte-specific factor 1,Gtsfl)在調(diào)控昆蟲和哺乳動物生殖細(xì)胞發(fā)育中具有重要功能,但在青蝦中未見上述2個基因相關(guān)研究的報道。本文從本實驗室構(gòu)建的青蝦精卵巢表達(dá)譜中篩選得到ETHR和Gtsf1的同源EST序列,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行cDNA克隆、成體組織和發(fā)育過程表達(dá)模式分析以及RNA干擾研究,以闡明ETHR和Gtsf1在青蝦中承擔(dān)的功能,藉此推動青蝦蛻皮和生殖細(xì)胞發(fā)育機(jī)制的研究。ETHR是一種G蛋白偶聯(lián)受體,它在昆蟲蛻皮過程中發(fā)揮著重要的生理作用,但在甲殼動物中未見相關(guān)研究報道。采用RACE技術(shù)克隆獲得青蝦ETHR基因cDNA序列長 1349 bp(Gen Bank 登錄號:KU532132),開放閱讀框(Open reading frame,ORF)為1173 bp,編碼390個氨基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測青蝦ETHR蛋白包含七個跨膜結(jié)構(gòu)域和在節(jié)肢動物中高度保守的特定功能位點,并發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽,屬于非分泌蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明青蝦ETHR蛋白與甲殼綱的大型水蚤(Daphnia magna)親緣關(guān)系最近。十個不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示,在腦組織中表達(dá)最高,表明大腦是ETHR活動的重要功能場所。胚胎不同發(fā)育時期表達(dá)結(jié)果顯示,ETHR基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)水平較低(卵裂、囊胚、原腸胚期),在無節(jié)幼體期逐漸增加,到蚤狀幼體階段ETHR基因的表達(dá)量顯著增加(P0.05),出膜后表達(dá)量急劇升高(P0.05)。蛻皮周期表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在腦組織和表皮中均發(fā)現(xiàn)ETHR在蛻皮前期迅速上升(P0.05),蛻皮后ETHR又恢復(fù)到較低水平,說明ETHR與青蝦蛻皮密切相關(guān)。RNA干擾降低了 ETHR的表達(dá)量,并使實驗組青蝦蛻皮頻率降低,約為對照組的一半,表明ETHR具有促進(jìn)青蝦蛻皮的作用。眼柄摘除能顯著提升ETHRmRNA的表達(dá),同時蛻皮頻率在眼柄摘除后升高了 30%,表明眼柄對ETHR基因表達(dá)和蛻皮具有抑制作用。Gtsf1基因參與果蠅和小鼠的性腺發(fā)育調(diào)控,在維持生殖細(xì)胞正常生成中發(fā)揮著重要作用,但在甲殼動物中未見研究報道。為了研究青蝦性早熟現(xiàn)象,本文采用RACE技術(shù)克隆獲得青蝦Gtsf1基因cDNA序列長349 bp((GenBank登錄號:KR349325),開放閱讀框(Open reading frame,ORF)為240 bp,編碼79個氦基酸。生物信息學(xué)分析預(yù)測青蝦Gtsf1蛋白包含1個zf-U11-48K結(jié)構(gòu)域,并發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽,屬于非分泌蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明Gtsf1基因青蝦Gtsf1蛋白與昆蟲綱的蝽類(Lygus hesperus)親緣關(guān)系最近。組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,Gtsf1基因在性腺中表達(dá)很高,特別是在卵巢中表達(dá)最高(為精巢的6倍),其他組織中表達(dá)極低。卵巢不同發(fā)育時期表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)育初期Gtsf1基因表達(dá)水平較低,隨著卵巢的發(fā)育,該基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P0.05),在成熟期達(dá)到最高峰,在消退期顯著下降并恢復(fù)到較低水平(P0.05)。胚胎和胚后不同發(fā)育時期結(jié)果顯示,Gtsf1基因在胚胎發(fā)育早期表達(dá)水平較高,囊胚期時顯著升高并達(dá)到峰值(P0.05),從原腸期顯著下降直至變態(tài)后第10天該基因表達(dá)水平維持較低水平(P0.05)。以上研究結(jié)果表明Gtsf1基因與生殖密切相關(guān),特別是在卵巢發(fā)育過程中有關(guān),且呈正相關(guān)趨勢。同時,Gtsf1基因可能主要參與青蝦胚胎早期發(fā)育的調(diào)控。研究首次在甲殼動物中克隆獲得Gtsf1基因,并分析Gtsf1基因在青蝦中的時空表達(dá)模式,研究結(jié)果為進(jìn)一步研究Gtsf1基因在青蝦的功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【圖文】：

化生物學(xué)等學(xué)科在內(nèi)的諸多領(lǐng)域顯示出其強(qiáng)大的生命力。一般認(rèn)為生殖細(xì)胞的發(fā)生分逡逑為原始生殖細(xì)胞（Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ邋Ｇｅｒｍ邋Ｃｅｌｌｓ，ＰＧ．Ｃｓ）的形成、遷移、胚胎性腺的發(fā)生以及配逡逑子發(fā)生等幾個主要的發(fā)育階段，如圖１－１邋（邵明喻，２００７）。生殖細(xì)胞是由存在卵子中逡逑—類特殊的細(xì)胞邐生殖質(zhì)（ｎｕａｇｅ或ｇｅｒｍ邋ｇｒａｎｕｌｅｓ）發(fā)育而來；生殖質(zhì)被認(rèn)為是生逡逑殖細(xì)胞的發(fā)源地，同時也被叫做維持種系延續(xù)的基地（桂建芳，２００４；吳萍，２００９）。逡逑目前己經(jīng)可以通過Ｖａｓａ、ｎａｎｏｓ等生殖細(xì)胞標(biāo)記基因來追蹤ＰＧＣｓ的發(fā)育和遷移逡逑（Ｙｏｏｎ邋ｅｔａｌ．，１９９７；邋Ｗｙｌｉｅ邋ｅｔａｌ．，２０００；邋Ｅｘｔａｖｏｕｒ邋ａｎｄ邋ＡｋａｍＭ，２００３）。逡逑邐胚胎發(fā)育邐邐配于發(fā)生邐逡逑ＰＧＣｓ形成｜邋ＰＧＣｓ遷移Ｉ胚胎性腺發(fā)生邐Ｉ分裂增殖｜減數(shù)分裂Ｉ邐精子形成逡逑２—邋一邋＂邐—衰逡逑Ｕ逡逑圖１－１生殖細(xì)胞的發(fā)生（引自邵明喻，２００７）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｇｅｎｉｉ邋ｃｅｌｌ逡逑根據(jù)生殖細(xì)胞的發(fā)育程度可分為：原原始生殖細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞、性原細(xì)胞、逡逑性母細(xì)胞和配子。原原始生殖細(xì)胞（ｐＰＧＣ）是生殖細(xì)胞的始祖細(xì)胞，進(jìn)行不對稱細(xì)逡逑胞分裂，產(chǎn)生兩個子細(xì)胞，其中一個子細(xì)胞維持生殖干細(xì)胞的特性，而另一個子細(xì)胞逡逑發(fā)育分化為體細(xì)胞；原始生殖細(xì)胞（ＰＧＣ）是性原細(xì)胞的祖細(xì)胞，其在遷移到達(dá)性腺逡逑原基過程中，發(fā)生分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞，并在細(xì)胞周圍的環(huán)境影響下，發(fā)育成為性原細(xì)逡逑胞

ＥＴＨＲ主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在腦中的表達(dá)量最高，其次是眼柄，鰓、肝逡逑臟、肌肉、腹腔神經(jīng)節(jié)和表皮。在卵巢、精巢和心臟中的表達(dá)顯著降低。在胚胎發(fā)育逡逑過程中ＥＴＨＲ的ｍＲＮＡ表達(dá)呈現(xiàn)一個上升趨勢（圖２－５），ＥＴＨＲ在早期胚胎發(fā)育過逡逑程中的表達(dá)較低，而在雖狀幼體期的表達(dá)水平顯著增加，出膜后ＥＴＨＲ表達(dá)量急劇升逡逑尚。逡逑６００邋－Ｉ邋３逡逑Ｓ邐５００邐－邋Ｉ逡逑？§邐４００邐－邐■逡逑Ｉ邐３００邐－邐Ｉ邐＂邐Ｔ邐＂邐＂邐ｂ邐ｂ逡逑Ｂｒ邐Ｅｙ邐Ｇｉ邐Ｈｅｐ邐Ｍｕ邐Ａｇ邐Ｅｐ邋0ｖ邋Ｔｅ邋Ｈｅａ逡逑Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅ逡逑圖２－４：日本沼蝦ＥＴＨＲ基因在成蝦不同組的表達(dá)逡逑Ｆｉｇ．２－４：邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐｒｏｆｉｌｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＥＴＨＲ邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｒｅｖｅａｌｅｄ邋ｂｙ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ逡逑ＰＣＲ逡逑注：組織包括腦、眼柄、鰓、肝臟、肌肉、腹神經(jīng)節(jié)、卵巢、精巢和心臟。數(shù)據(jù)顯示為平均值士逡逑標(biāo)準(zhǔn)差。不同組織間的統(tǒng)計學(xué)差異用大寫字母表示，不同的字母表示差異顯著（Ｐ＜邋０．０５）。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ｔｉｓｓｕｅｓ邋ｉｎｃｌｕｄｅｄ：邋Ｂｒ，ｂｒａｉｎ；邋Ｅｙ，邋ｅｙｅｓｔａｌｋ；邋Ｇｉ，ｇｉｌｌ；邋Ｈｅｐ，ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ．邋Ｍｕ，逡逑ｍｕｓｃｌｅ；邋Ａｇ

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2715726