【摘要】：魚類作為脊椎動物中最大的一個類群,具有極其復(fù)雜的性別決定方式,主要分為基因型性別決定(genotypic sex determination,GSD)、環(huán)境型性別決定(environmental sex determination,ESD)兩種類型。而且,在性別決定完成之后,魚類的性別分化過程也受到諸多因素的影響。目前認(rèn)為,在魚類的性別分化過程中,性激素起到了決定性的作用,尤其是雌激素。而內(nèi)源性雌激素合成受到其合成限速酶芳香化酶(cyp19a1a)的控制。此外,魚類中促性腺激素(gonadtropin,GtH)能通過調(diào)控cyp19a1a等性激素合成限速酶編碼基因的表達(dá)來改變性腺中性激素的水平。而且,很多研究表明GtH之一促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)可能參與到魚類的性別分化過程。斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)是一種雌雄同體雌性先熟的魚類,其性腺全部先分化為卵巢,因此其可作為研究魚類性別分化的理想材料。我們的之前的研究發(fā)現(xiàn),斜帶石斑魚促性腺激素及其受體fshr在性腺分化過程中高表達(dá),表明它們可能調(diào)控斜帶石斑魚的性別分化,但該信號調(diào)控石斑魚性分化的功能和分子機(jī)制還不清楚。基于此,本研究以斜帶石斑魚為研究對象,探討FSH在其先雌性分化過程中的作用及其分子機(jī)制,主要研究結(jié)果如下:1.通過對分化期的斜帶石斑魚進(jìn)行FSH長期注射,發(fā)現(xiàn)FSH注射首先加速了卵巢分化的進(jìn)程,但是隨后卻誘導(dǎo)了雄性命運(yùn)。檢測FSH處理過程性腺中的基因表達(dá)量發(fā)現(xiàn),雌性相關(guān)基因的表達(dá)量起初上調(diào)但隨后出現(xiàn)顯著性下降,而雄性相關(guān)基因則只呈現(xiàn)上調(diào)的表達(dá)模式。性類固醇合成通路相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)量在處理過程呈現(xiàn)顯著性上升的表達(dá)模式。與之相符,血清中雌雄激素水平也出現(xiàn)顯著性上升。對分化期的斜帶石斑魚進(jìn)行短時間FSH注射發(fā)現(xiàn),低劑量FSH注射激活雌性相關(guān)基因(特別是cyp19a1a)的表達(dá),但高劑量下卻抑制雌性相關(guān)基因的表達(dá),激活雄性相關(guān)基因的表達(dá)。離體實驗(HEK293T細(xì)胞)發(fā)現(xiàn),低劑量的FSH能激活cyp19a1a的表達(dá),但高劑量的FSH卻沒這個效果。綜上所述,FSH的功能與其濃度相關(guān),即低濃度誘導(dǎo)卵巢分化而高濃度則誘導(dǎo)雄性命運(yùn)。2.對未分化(孵化后50天)的斜帶石斑魚進(jìn)行甲基睪酮(17α-methyltestosterone,MT)投喂或者甲基睪酮和雌二醇(17β-estradiol,E2)同時投喂(MT+E2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT投喂導(dǎo)致性腺不育,而同時投喂E2可以拯救這種表型。在斜帶石斑魚的性別分化期間(孵化后90天)進(jìn)行MT或者M(jìn)T+E2投喂都會誘導(dǎo)雄性命運(yùn)。檢測性別相關(guān)基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),MT和MT+E2投喂抑制雌性相關(guān)基因的表達(dá),而上調(diào)雄性相關(guān)基因的表達(dá)。與基因表達(dá)模式相符,血清11-KT水平也在MT和MT+E2投喂組中上調(diào)。隨后我們還追蹤了MT和MT+E2誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)過程中的雄性標(biāo)記DMRT1以及細(xì)胞增殖抗原的表達(dá)細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄性生殖細(xì)胞以及精巢體細(xì)胞可能分別來自于原有性腺中的性原細(xì)胞以及體細(xì)胞。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)在斜帶石斑魚中,雌激素扮演了天然誘導(dǎo)卵巢分化的角色,而雄激素能夠在外源雌激素補(bǔ)償?shù)那闆r下誘導(dǎo)雄性命運(yùn)。3.使用不同劑量的芳香化酶抑制劑(aromatase inhibitor,AI)投喂分化期的斜帶石斑魚,結(jié)果低劑量的AI使性腺停滯在未分化的狀態(tài),而高濃度的AI則誘導(dǎo)了雌性到雄性的性逆轉(zhuǎn)。有趣的是,對未分化的斜帶石斑魚進(jìn)行AI和AI+E2投喂,結(jié)果都誘導(dǎo)了由雌到雄的性逆轉(zhuǎn)。而誘導(dǎo)雄性命運(yùn)之后停止AI和AI+E2投喂,性腺則會退回到原始性腺狀態(tài)并重新開始卵巢分化。檢測投喂過程中性別分化相關(guān)基因的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn),AI和AI+E2投喂抑制雌性相關(guān)基因的表達(dá),而上調(diào)雄性相關(guān)基因的表達(dá);停止投喂后,AI和AI+E2投喂對雌性相關(guān)基因的抑制作用和對雄性相關(guān)基因激活作用都消失,其表達(dá)量都回復(fù)到與對照組接近的水平。與基因表達(dá)模式相符,血清11-KT水平也在AI和AI+E2投喂組中上調(diào);停止AI和AI+E2投喂后,血清E2水平下降程度顯著變小,而11-KT水平則出現(xiàn)顯著下降。最后我們還檢測了處理過程中細(xì)胞凋亡和增殖信號,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在天然的卵巢分化過程中,激素生成細(xì)胞增殖,使雌激素合成上調(diào),促進(jìn)卵巢分化;而AI和AI+E2投喂誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡形成輸出小管,隨后周圍出現(xiàn)雄性生殖細(xì)胞,但并沒有雄性激素生成細(xì)胞的增殖出現(xiàn);停止AI和AI+E2投喂后,激素生成細(xì)胞增殖,重新分化出卵巢腔。綜上所述,在斜帶石斑魚性別分化過程中,cyp19a1a的表達(dá)上升誘導(dǎo)了天然卵巢分化,而只要抑制了cyp19a1a的表達(dá)就會誘導(dǎo)精巢分化。4.使用MT、E2和MT+E2對分化期的斜帶石斑魚進(jìn)行腹腔注射,3-24 h后檢測fshβ的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這三種處理均能夠上調(diào)垂體中fshβ的表達(dá)。隨后我們克隆得到fshβ啟動子,并預(yù)測了該啟動子上雌激素和雄激素的響應(yīng)元件(ERE和ARE),發(fā)現(xiàn)其具有兩個ERE和4個ARE。離體細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),E2能通過era激活fshβ啟動子活性,而11-KT則通過ara和arb激活fshβ啟動子活性。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 王德壽,吳天利,張耀光;魚類性別決定及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J];西南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2000年03期

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本文編號：2709592