【摘要】：文昌魚是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物,在進(jìn)化上位于脊椎動(dòng)物與無脊椎動(dòng)物之間,是研究進(jìn)化發(fā)育的過渡模型。本文對(duì)青島文昌魚髓過氧化物酶基因進(jìn)行了克隆,獲得了其髓過氧化物酶基因序列,為研究青島文昌魚的進(jìn)化發(fā)育、免疫等提供了分子基礎(chǔ)。髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)是過氧化物酶家族的重要成員之一,主要存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中,是含血紅素輔基的血紅素蛋白酶,是反應(yīng)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的特異性指標(biāo)。髓過氧化物酶存在于動(dòng)物體內(nèi)或其分泌物中,植物中暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)。目前關(guān)于髓過氧化物酶的報(bào)道較多集中于人類髓過氧化物酶的研究。髓過氧化物酶氧化反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧和氯胺(NH2Cl)在機(jī)體防御中起重要作用;但同時(shí)生成的活性氧在產(chǎn)生超過機(jī)體清除時(shí)就會(huì)對(duì)正常組織如內(nèi)皮細(xì)胞、脂質(zhì)、DNA產(chǎn)生損傷,導(dǎo)致多種疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、白血病、腎炎、多發(fā)性炎、腫瘤等。本文采用RT-PCR和RACE技術(shù)首次克隆了青島文昌魚髓過氧化物酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列是3403bp,5'端非編碼區(qū)長(zhǎng)379bp,3'端非編碼區(qū)長(zhǎng)642bp,開放閱讀框全長(zhǎng)2379bp,編碼793個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其理論分子質(zhì)量為87074.09Da,理論等電點(diǎn)為4.78,預(yù)測(cè)該蛋白屬于分泌蛋白,存在信號(hào)肽,具有1個(gè)跨膜區(qū),且絕大部分蛋白位于膜外。由此可以推測(cè)青島文昌魚髓過氧化物酶基因編碼的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成,經(jīng)過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),分泌到胞外發(fā)揮作用。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明文昌魚的髓過氧化物酶基因位于脊椎動(dòng)物大分支和無脊椎動(dòng)物大分支的中間,并且更偏向于脊椎動(dòng)物。原位雜交實(shí)驗(yàn)與DAB染色實(shí)驗(yàn)表明,髓過氧化物酶基因在文昌魚的表皮、肝盲囊、脊髓中均有表達(dá),在肝盲囊和脊髓周圍等表達(dá)較高,推測(cè)原因是表皮和肝盲囊是構(gòu)成文昌魚免疫系統(tǒng)的重要部位,而髓過氧化物酶是免疫反應(yīng)中重要的酶類之一;至于脊髓高表達(dá)的原因有待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

Trizol 提取液：Invitrogen 公司，主要無菌去離子水、DEPC 水、氯仿（三2.1.1.2 器具及試劑前期準(zhǔn)備塑料制品：（槍頭、離心管、研磨棒用 0.1%的 DEPC 水浸泡槍頭、離心浸泡過夜，高壓，烤干備用，來使 RNas玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，再裹，，150℃烘烤 4 小時(shí)（或 180℃烘烤 2 金屬制品（包括剪刀、鑷子等）：先水。試劑準(zhǔn)備：Trizol 試劑、異丙醇、72.1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法及原理利用 Trizol 法提取青島文昌魚的總 檢測(cè)文昌魚 RNA 的質(zhì)量如圖 2.1 所

使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體實(shí)驗(yàn)方法見附錄7。PCR產(chǎn)物各取5μ l進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如下圖2.2：M: DL2,000 DNA Marker1：F2/R4 PCR產(chǎn)物(+)2：F2/R4 PCR產(chǎn)物(-)圖 2.2 同源基因擴(kuò)增結(jié)果Figure2.2 The result of homologous gene amplified2.2.4 PCR 產(chǎn)物純化使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver試劑盒切膠回收純化上述第1泳道長(zhǎng)度約1.8kbp、1.6kbp的目的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，依次命名為PCR1、PCR2。
【學(xué)位授予單位】：魯東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2709381