【摘要】：在地球漫長(zhǎng)演化進(jìn)程中,氣候環(huán)境不斷變化,極地海域的水溫逐漸從15℃變化到-1.9℃,導(dǎo)致許多極地魚死亡,而有些極地海洋魚類為了能夠適應(yīng)常年的低溫,逐漸進(jìn)化出了能夠抵抗寒冷低溫的機(jī)制,其中抗凍蛋白(AFP)的產(chǎn)生就是極地魚的一種典型的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制。Scholander和DeVries兩位科學(xué)家在極地海洋中的一些魚中首先發(fā)現(xiàn)有些魚可以在零度以下的冷水中存活。后來(lái),研究發(fā)現(xiàn)極地魚類體內(nèi)存在著一類能抵抗寒冷的蛋白,這一類蛋白質(zhì)被稱為AFPs。目前在魚類中發(fā)現(xiàn)了5種抗凍蛋白,AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ和AFGPs,這幾種AFPS之間的蛋白序列特征,空間結(jié)構(gòu)以及進(jìn)化來(lái)源等在不同的物種間有著巨大差異,其抗凍功能可能與其序列和結(jié)構(gòu)特異性有關(guān)�？箖龅鞍椎淖饔梅绞街饕峭ㄟ^(guò)抑制極地魚體內(nèi)冰晶的形成。南極魚Lycodichthys dearborni(LD),體內(nèi)含有豐富的AFPⅢ,本實(shí)驗(yàn)室從南極魚的多聚AFPⅢ基因ld12 cDNA中克隆得到AFPⅢ蛋白四聚體,構(gòu)建LD4質(zhì)粒。低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致魚類生理功能失調(diào)、機(jī)體損傷甚至死亡,細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生各種適應(yīng)性變化來(lái)應(yīng)對(duì)這種低溫脅迫,以有利于存活。在各種脅迫下,哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生。應(yīng)激顆粒(Stress granules,SG)的產(chǎn)生是細(xì)胞的一種自我保護(hù)的防御機(jī)制,它是細(xì)胞在受到環(huán)境脅迫(如熱休克、氧化性刺激、病毒感染等)時(shí),抑制細(xì)胞內(nèi)mRNA的翻譯形成包含翻譯起始因子、未翻譯的mRNA和G3BP1,TIA-1等蛋白致密顆粒。這種顆粒已經(jīng)在酵母、植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到證實(shí)。應(yīng)激顆粒在低溫脅迫下的研究主要集中于哺乳動(dòng)物細(xì)胞模型,而其在魚類細(xì)胞中鮮有報(bào)道�；谒鼈兊墓δ芟嗨菩�,實(shí)驗(yàn)室?guī)熃阊芯縧d4的功能時(shí),在HeLa細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下ld4的表達(dá)可以使細(xì)胞中應(yīng)激顆粒的形成減少。這也就為我們?cè)诎唏R魚胚胎成纖維細(xì)胞(ZF4)中研究?jī)烧唛g的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)將首先探究低溫脅迫下ZF4細(xì)胞中的應(yīng)激顆粒的形成。我們?cè)O(shè)置溫度梯度18℃、13℃和10℃作為低溫脅迫溫度,低溫處理不同時(shí)間后,利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)探究應(yīng)激顆粒的形成以及應(yīng)激恢復(fù)時(shí)SG的解聚情況。結(jié)果如下:1)ZF4細(xì)胞在低溫脅迫下,與28℃下培養(yǎng)的細(xì)胞相比,無(wú)論是在18℃、13℃還是10℃低溫處理下,通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同溫度的低溫脅迫下,ZF4細(xì)胞會(huì)聚集形成應(yīng)激顆粒,并且在10℃低溫處理1h,13℃低溫處理4h,18℃低溫處理24h時(shí),應(yīng)激顆粒形成最明顯。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)10℃低溫處理1h,13℃低溫處理4h,18℃低溫處理24h時(shí)tial1、g3bp1的mRNA水平有顯著性差異(p0.001)。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨著脅迫溫度的降低,應(yīng)激顆粒的形成速度也在加快。2)ZF4細(xì)胞中應(yīng)激顆粒的形成表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒數(shù)量增多和直徑變大。3)在13℃低溫處理4h后,進(jìn)行應(yīng)激恢復(fù)(28℃)時(shí),應(yīng)激顆粒會(huì)在短時(shí)間(十幾分鐘左右)迅速溶解。這種應(yīng)激顆粒在脅迫消失后的快速解聚過(guò)程也與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似。4)應(yīng)激顆粒的解聚主要表現(xiàn)為應(yīng)激顆粒的快速溶解消散。低溫脅迫下,ZF4細(xì)胞中證實(shí)有應(yīng)激顆粒形成。我們將ld4轉(zhuǎn)染進(jìn)ZF4細(xì)胞中,檢測(cè)ld4成功表達(dá)的情況下應(yīng)激顆粒的形成情況。結(jié)果如下:1)通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn),證明在ZF4細(xì)胞中l(wèi)d4基因在蛋白水平都成功表達(dá)2)低溫脅迫下,ld4基因的成功表達(dá)可以明顯提高ZF4細(xì)胞的存活率。3)ZF4細(xì)胞免疫熒光和RT-qPCR實(shí)驗(yàn)表明,低溫脅迫下,ld4的成功表達(dá)可以降低細(xì)胞中應(yīng)激顆粒的產(chǎn)生。4)低溫脅迫下,轉(zhuǎn)染ld4重組質(zhì)粒的ZF4細(xì)胞p-eIF2a和p53表達(dá)下降。以上研究結(jié)果表明,低溫脅迫下ZF4細(xì)胞可以形成應(yīng)激顆粒,并且脅迫消失應(yīng)激顆粒也會(huì)迅速解聚。隨著脅迫溫度的降低,應(yīng)激顆粒的形成速度也在加快。本文首次發(fā)現(xiàn)魚類細(xì)胞在低溫下形成應(yīng)激顆粒,主要成分與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似,表明應(yīng)激顆粒是動(dòng)物細(xì)胞應(yīng)對(duì)低溫刺激的普遍反應(yīng)機(jī)制。低溫脅迫下,發(fā)現(xiàn)LD4可以通過(guò)抑制翻譯起始因子eIF2a的磷酸化使tial1、g3bp1水平下降,導(dǎo)致應(yīng)激顆粒的形成減少。(應(yīng)激顆粒作為細(xì)胞的保護(hù)性機(jī)制,那么應(yīng)激顆粒的減少,會(huì)不會(huì)對(duì)細(xì)胞有什么不利影響呢,于是我們檢測(cè)了與凋亡相關(guān)的p53的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)低溫在斑馬魚細(xì)胞中p53的表達(dá)量明顯減少。說(shuō)明應(yīng)激顆粒的減少并沒(méi)有對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生影響。)我們猜測(cè)可能LD4可能對(duì)應(yīng)激顆粒的作用起到了一個(gè)補(bǔ)償作用。本實(shí)驗(yàn)在低溫脅迫下,關(guān)于LD4和應(yīng)激顆粒的初步探究,期望可以為ZF4細(xì)胞低溫下應(yīng)激顆粒的研究提供理論支持,也希望可以為ld4基因作為魚類耐寒育種的候選基因提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文檬形狀[50]。中度活躍的 AFP 能夠與棱鏡或錐體平面結(jié)合[49, 51, 52]，而過(guò)度活P 能夠與冰晶的基面結(jié)合[51, 53]。由 AFP 形成的冰形態(tài)是 AFP 與冰相結(jié)合的（圖 1-3）。 TH 已被用于確定描述 AFP 的活性。對(duì)于大多數(shù)魚類 AFP，觀 TH 活性約為 1°C[54, 55]。在冬季（-1.9°C），這種溫差為海水提供足夠的緩沖地魚在寒冷的環(huán)境中生存。除魚類 AFP 外，許多海洋 AFP 與海冰有關(guān)[56-59地魚類的血漿不同，海冰中鹽水通道中的海水會(huì)凍結(jié)成冰。因此，來(lái)自海細(xì)菌，微藻類和真核原生生物的 AFP 被分泌到周圍環(huán)境中，以保護(hù)自身不50, 56, 57]。

來(lái)，低溫脅迫作為酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生 SG 的多人注意到。研究表明寒冷刺激誘導(dǎo)的SGs僅在低溫?cái)?shù)小時(shí)佳生長(zhǎng)溫度后幾分鐘內(nèi) SG 迅速溶解。這與熱刺激或亞砷（SGs 大約在 15-30 分鐘后出現(xiàn)，但在應(yīng)激恢復(fù)時(shí)需要 30[6]。迫下哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 PERK 激酶（蛋白激酶 R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)化，致使 SG 形成。此外，寒冷刺激這種溫度脅迫致使細(xì)胞胞的能量消耗受到影響，翻譯速率降低，某些蛋白功能激胞損傷。在葡萄糖饑餓（缺少）的情況下，也發(fā)現(xiàn)翻譯抑細(xì)胞存活率。有研究表明低溫脅迫下 cos7（非洲綠猴腎成，促使 SG 形成，并且促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在低溫下的存活譯抑制下產(chǎn)生的 SG 與翻譯抑制下細(xì)胞存活之間存在什么楚，仍需要感興趣的研究者進(jìn)一步探究。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

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