【摘要】：翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)隸屬鱸形目(Perciformes)、鱖亞科(Sinipercinae)、鱖屬(Siniperca),是我國(guó)淡水優(yōu)質(zhì)魚(yú)類。至2014年,全國(guó)鱖魚(yú)產(chǎn)量已達(dá)293 853噸,廣東、江西、安徽等地區(qū)是主要養(yǎng)殖省份。養(yǎng)殖密度的增加導(dǎo)致水體生態(tài)環(huán)境惡化;長(zhǎng)期人工繁殖忽視親本選育,導(dǎo)致鱖魚(yú)種質(zhì)退化,出現(xiàn)生長(zhǎng)速度下降及抗病力降低的問(wèn)題。因此,選育生長(zhǎng)快的品種對(duì)鱖魚(yú)養(yǎng)殖至關(guān)重要。體重是衡量魚(yú)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)之一。骨骼肌占活魚(yú)體重的30%~80%,是魚(yú)體的主要組成部分,也是研究魚(yú)類生長(zhǎng)的重要材料。大多數(shù)魚(yú)類在出生后通過(guò)肌纖維的不斷增生和肥大兩個(gè)過(guò)程進(jìn)行肌肉生長(zhǎng),肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程被生長(zhǎng)因子、調(diào)控蛋白、miRNA、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)通路等多水平精確調(diào)控。MicroRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)度約22 nt非編碼小RNA,主要通過(guò)種子序列與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)水平從而參與生物體的生長(zhǎng)與發(fā)育、疾病等多種生理過(guò)程。在本研究中,我們以生長(zhǎng)存在顯著差異的慢長(zhǎng)組、快長(zhǎng)組翹嘴鱖肌肉為材料,采用Illumina HiSeq深度測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)及實(shí)驗(yàn)方法,初步篩選與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的miRNA,以期為鱖魚(yú)分子選育種提供候選基因。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.翹嘴鱖miRNA的鑒定及保守miRNA堿基編輯情況統(tǒng)計(jì)本研究通過(guò)HiSeq高通量測(cè)序?qū)βL(zhǎng)組和快長(zhǎng)組進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,組裝、拼接后分別獲得11241781和11410753條干凈序列。與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),一共獲得翹嘴鱖保守miRNA 433個(gè),其中快長(zhǎng)組有413個(gè),慢長(zhǎng)組410個(gè)。統(tǒng)計(jì)已知miRNA堿基編輯情況,結(jié)果顯示在快長(zhǎng)組、慢長(zhǎng)組中分別發(fā)生2336、2143處堿基編輯,其中出現(xiàn)次數(shù)較高的編輯類型是G-to-U與U-to-C,出現(xiàn)次數(shù)較低的編輯類型是C-to-U與C-to-A。miRNA編輯不僅增加了miRNA轉(zhuǎn)錄組的功能多樣性,也是轉(zhuǎn)錄組進(jìn)化穩(wěn)定的特征。這些數(shù)據(jù)的獲得與分析豐富了鱖魚(yú)轉(zhuǎn)錄組信息。2.快長(zhǎng)與慢長(zhǎng)組差異表達(dá)miRNAs的鑒定與q-PCR驗(yàn)證采用Expdiff方法在快長(zhǎng)與慢長(zhǎng)組間鑒定出8個(gè)差異miRNAs,進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證這些差異表達(dá)的miRNAs。其中miR-122、miR-192、miR-200b-5p、mi R-451在慢長(zhǎng)組中顯著上調(diào);而let-7j-5p、mi R-499-5p、miR-10b-3p、miR-204-3p則在快長(zhǎng)組中顯著上調(diào)。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法驗(yàn)證:miR-122、mi R-192、miR-451在慢長(zhǎng)組中高表達(dá),它們?cè)趦山M間均存在顯著差異(p0.05),與測(cè)序結(jié)果一致,但miR-200b-5p則為顯著低表達(dá);驗(yàn)證結(jié)果顯示let-7j-5p在快長(zhǎng)組中也為高表達(dá),但miR-499-5p、miR-10b-3p卻為低表達(dá),其中l(wèi)et-7j-5p和miR-499-5p在兩組間均為顯著差異,而miR-10b-3p則為極顯著差異;miR-204-3p在兩組間則差異不顯著。這一結(jié)果為進(jìn)一步了解miRNA對(duì)翹嘴鱖生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控提供基礎(chǔ)。3.差異表達(dá)miRNAs的靶基因預(yù)測(cè)及KEGG通路注釋利用軟件RNAhybrid和Targetscan對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),將靶基因進(jìn)行KEGG Pathway顯著性富集分析。取兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集,獲得36 065個(gè)miRNA-靶基因mRNA,分析miRNA-靶基因交互作用的遺傳多態(tài)性的數(shù)據(jù),以期對(duì)翹嘴鱖分子育種提供有用信息。mRNA經(jīng)KEGG富集分析可注釋到307個(gè)信號(hào)通路,這些通路涉及生長(zhǎng)、代謝、發(fā)育等發(fā)面。其中Wnt信號(hào)通路是一個(gè)重要的魚(yú)類骨骼肌信號(hào)通路。4.qRT-PCR分析翹嘴鱖miR-192的胚胎表達(dá)模式miR-192是上述研究中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miRNA之一,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR對(duì)其胚胎表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-192為母源性表達(dá)基因,在未受精的魚(yú)卵中能檢測(cè)到表達(dá),在受精卵到開(kāi)口期表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì):在未受精卵、受精卵和多細(xì)胞期都有大量表達(dá),之后在囊胚期其表達(dá)量急劇下降;從原腸胚期到肌肉效應(yīng)期僅檢測(cè)到其極低表達(dá)量;而從出膜期到開(kāi)口期表達(dá)急劇上升。miR-192可能在翹嘴鱖胚胎的分化發(fā)育過(guò)程起重要作用。
【圖文】：

圖 1 miRNA 合成示意圖Figure 1 miRNA biogenesis pathway（Farazi et el., 2013）第一階段（細(xì)胞核內(nèi)）① miRNA 基因由 RNA 聚合酶 II（RNase II）或 RNA 聚合酶 III（成具有 5’端帽子結(jié)構(gòu)、3’端 Poly（A）尾的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物（pri-mimiRNA 序列較長(zhǎng)，長(zhǎng)度從數(shù)百到數(shù)千 nt 不等，有的是單順?lè)醋樱▎问嵌囗樂(lè)醋樱ǘ喟l(fā)卡結(jié)構(gòu)）。pri-miRNA 進(jìn)一步經(jīng) Drosha 酶剪切形環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNA 前體（pre-miRNA），這一過(guò)程通常需要迪格奧區(qū)蛋白 8（Dgcr8)和雙鏈 RNA 結(jié)合域蛋白的參與，有時(shí)還需要其它68/p53,KH 型剪切調(diào)控蛋白(KSRP)[9-11]。Drosha 酶是一種 RNA 內(nèi)鏈 RNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、RNA 酶 III 結(jié)構(gòu)域和功能待定的 N 末端，’端進(jìn)行磷酸化、3’端加入羥基[12]。因此，pre-miRNA 3’端有典型構(gòu)。②不經(jīng) Drosha 酶剪切，細(xì)胞核內(nèi)的 mRNA 通過(guò)剪切體作用剪切下

圖 2 miRNA 作用機(jī)制示意圖Figure2 Examples of miRNAmechanisms of action（Bizuayehu & Babiak, 2011）1.3.1 miRISC 與 mRNA 的相互作用機(jī)制miRNA 成熟體的 5’端 2-8 位高度保守，被稱作種子序列（seed se子序列是不完全互補(bǔ)配對(duì)的主要決定因素。目前，miRNA-靶 mRNA 相模型有：Seed matching：種子序列與靶基因 mRNA 的 3’-UTR 堿基配對(duì)matching：靶基因 mRNA 的 3’-UTR 不包含相應(yīng) miRNA 的種子序列，仍能與其部分堿基互補(bǔ)[27]、Centered paired site：mRNA 與 miRNA 的中11-12 個(gè)連續(xù)堿基配對(duì)[28]、Pivot pairing and transitional nucleation modesites[29]。1.3.2 miRNA 的調(diào)控細(xì)胞中，miRNA 的調(diào)控機(jī)制嚴(yán)謹(jǐn)而復(fù)雜。miRNA 調(diào)控可以劃分以下①轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控 miRNA 所處的基因組位置上的啟動(dòng)子和miRNA 的轉(zhuǎn)錄。有些 miRNA 簇在一個(gè)基因簇中有多個(gè)啟動(dòng)子，如人類
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2706004