【摘要】：牡蠣皰疹病毒魁蚶株(SB strain of Ostreid herpesvirus-1,Os HV-1-SB)是由2012年6月本實(shí)驗(yàn)室從山東長島、萊州、日照和即墨等地的養(yǎng)殖基地魁蚶樣品中檢測獲得,其感染健康魁蚶后,主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、觸碰后雙殼不閉合或閉合緩慢,外套膜內(nèi)縮,內(nèi)臟團(tuán)呈灰白色或黑灰色。出現(xiàn)上述癥狀的個體一般1d內(nèi)就會死亡,其死亡率可達(dá)到75%,目前關(guān)于該病毒的有效檢測方法尚未建立。本論文根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測序完成的Os HV-1-SB全基因組序列,運(yùn)用交叉引物等溫?cái)U(kuò)增(cross priming amplification,CPA)技術(shù),通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化、CPA產(chǎn)物的酶切鑒定、CPA靈敏度實(shí)驗(yàn)、CPA特異性實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品的檢測,為Os HV-1-SB建立了一種現(xiàn)場簡單、快速、高靈敏度的檢測方法。同時,運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)對2010年全年實(shí)驗(yàn)室采集貝類樣品中派琴蟲感染情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,以期為派琴蟲的有效防控提供一定的理論依據(jù)。研究方法和部分結(jié)果如下:第一部分:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測序完成的Os HV-1-SB全基因組序列(文未發(fā)),選擇其保守區(qū)域作為CPA反應(yīng)的靶序列,使用Primer Explorer 4.0引物設(shè)計(jì)軟件,設(shè)計(jì)出一套CPA反應(yīng)引物,并對反應(yīng)體系的溫度、d NTPs和Mg2+濃度和反應(yīng)時間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示,最佳溫度為63℃,反應(yīng)時間為60 min,d NTPs濃度為1.4mmol/L,Mg2+濃度為6 mmol/L。該方法檢測靈敏度為30拷貝的質(zhì)粒DNA,并且特異性較強(qiáng),與貝類常見病原急性病毒性壞死病毒、鮑魚皰疹病毒、派琴蟲、包納米蟲、馬爾泰蟲以及對蝦白斑綜合征病毒和副溶血弧菌均無交叉反應(yīng)。并使用實(shí)驗(yàn)建立的CPA檢測方法對2012年分別采自韓國慶尚南道、山東長島、遼寧大連共計(jì)22份Os HV-1-SB感染情況未知的魁蚶樣品進(jìn)行了檢測。研究表明,實(shí)驗(yàn)所建立的Os HV-1-SB的CPA檢測方法簡單、快速、靈敏且特異性強(qiáng)。由于其檢測結(jié)果可通過簡單離心觀察白色沉淀或者向反應(yīng)管中加入核酸熒光染料Gene FinderTM通過顏色變化進(jìn)行陰陽性判斷,所以可以在沿海條件簡陋的貝類養(yǎng)殖廠及實(shí)驗(yàn)室使用,具有較好的應(yīng)用前景。第二部分:派琴蟲是危害貝類養(yǎng)殖業(yè)的主要寄生蟲,實(shí)驗(yàn)通過對2010年全年采自山東青島、山東榮成、山東長島、廣東惠安和福建霞浦的共計(jì)548份貝類樣品,提取核酸后使用OIE推薦的PCR檢測方法對派琴蟲進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示,全部樣品中奧爾森派琴蟲的陽性率達(dá)到了21.17%,其中青島流清河貝類樣品中櫛孔扇貝(蓬萊紅和野生苗)陽性率為22.00%,貽貝陽性率為55.00%;榮成桑溝灣櫛孔扇貝(蓬萊紅、野生苗和人工苗)陽性率為16.30%,貽貝陽性率為18.52%;煙臺長島縣貝類樣品陽性率較低,只有皺紋盤鮑檢測到陽性,櫛孔扇貝野生苗和蝦夷扇貝中均沒有檢測到奧爾森派琴蟲。同時,對各月份采集貝類樣品奧爾森派琴蟲的整體陽性比率進(jìn)行匯總分析,結(jié)果顯示,奧爾森派琴蟲感染主要發(fā)生在夏季水溫較高季節(jié),其中在7月達(dá)到了峰值。而在1、2、12月水溫較低時期,未檢測到奧爾森派琴蟲感染陽性樣品。第三部分:急性病毒性壞死病毒(AVNV)是阻礙櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原,本文根據(jù)已完成的AVNV全基因組序列,通過PCR技術(shù)得到編碼AVNV多重跨膜蛋白的ORF110基因,并進(jìn)行了TA克隆得到p MD18-T-110質(zhì)粒,經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sna BⅠ和NotⅠ雙酶切后和真核表達(dá)載體p PIC9K連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建得到用于蛋白表達(dá)的重組質(zhì)粒p PIC9k-ORF110。經(jīng)電轉(zhuǎn)化后,將重組質(zhì)粒整合到畢赤酵母GS115中,使用甲醇進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),同時在表達(dá)過程中使用光學(xué)顯微鏡對酵母形態(tài)進(jìn)行了觀察,以便確認(rèn)表達(dá)過程中無雜菌污染。
【圖文】：

圖 2-1 OsHV-1-SB CPA 反應(yīng)體系溫度優(yōu)化2000TMDNAMarker；1~6：分別對應(yīng) 59、61、63、65、67 和 691 Optimization of the reaction temperature of the OsHV-1-SB CPAasDNAMarker；Lanes 1-6 are different reaction temperatures: 59, 61, 6

濃度的優(yōu)化結(jié)果應(yīng)溫度基礎(chǔ)上，單一變量對 CPA 體系中 MgCl2濃度進(jìn)泳顯示，當(dāng)反應(yīng)體系中 MgCl2濃度為 6 mmol/L 時，電圖 2-2）。因此，，在 OsHV-1-SB CPA 反應(yīng)體系中以 6 mA 的最佳 MgCl2濃度。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S944

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 董時軍;;人皰疹病毒流行現(xiàn)狀[J];傳染病信息;2006年02期

2 謝麗基;謝芝勛;龐耀珊;劉加波;鄧顯文;謝志勤;范晴;羅思思;;中國沿海主要養(yǎng)殖貝類四種原蟲病流行病學(xué)的調(diào)查研究[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2012年06期

3 梁玉波,張喜昌,王立俊;貝類典型寄生蟲病害[J];海洋環(huán)境科學(xué);2003年04期

4 賈志磊;王崇明;任偉成;梁彥韜;曲朋;李峗;;急性病毒性壞死病毒dUTPase基因的克隆、表達(dá)及其產(chǎn)物的酶學(xué)活性分析[J];水產(chǎn)學(xué)報;2011年09期

5 徐芊;孫曉紅;趙勇;潘迎捷;;副溶血弧菌LAMP檢測方法的建立[J];中國生物工程雜志;2007年12期

6 宋凌浩;符麗媛;趙志田;狄彪;尤其敏;;CPA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在口岸蚊媒攜帶登革病毒檢測中的應(yīng)用[J];西南林學(xué)院學(xué)報;2010年S1期

7 羅詞興;黃旭雄;李桑;趙利斌;危立坤;陳春燕;劉林林;曾蓓蓓;;溶藻弧菌感染后凡納濱對蝦鰓組織免疫相關(guān)基因的表達(dá)[J];中國水產(chǎn)科學(xué);2014年01期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 任偉成;櫛孔扇貝急性病毒性壞死病毒基因組全序列的測定和核酸診斷技術(shù)的研究[D];中國海洋大學(xué);2009年

本文編號：2702473