【摘要】：嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖中的主要致病菌,可引起爆發(fā)性的敗血癥,給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。嗜水氣單胞菌高效亞單位疫苗的制備和研發(fā)在減少抗生素的使用、保持水產(chǎn)品安全等方面具有積極的意義。本文以該菌外膜蛋白o(hù)mpF和ompK為研究對(duì)象,評(píng)價(jià)了其對(duì)歐洲鰻鱺的免疫保護(hù)效果,旨在為開發(fā)嗜水氣單胞菌高效亞單位疫苗提供備選材料。以一株致病性鰻源嗜水氣單胞菌作為研究材料,通過(guò)SDS-PAGE分析了該菌株外膜蛋白的組成,分別用歐洲鰻鱺感染嗜水氣單胞菌全菌后的恢復(fù)期血清和兔抗嗜水氣單胞菌外膜蛋白的血清進(jìn)行Western-blot印跡分析,發(fā)現(xiàn)28、37、43和45 kD的4個(gè)蛋白條帶都發(fā)生了陽(yáng)性反應(yīng)。同時(shí)通過(guò)SDS-PAGE對(duì)比了這5株不同氣單胞菌的外膜蛋白組成,發(fā)現(xiàn)分子量為28 kD的外膜蛋白為這5株氣單胞菌所共有。對(duì)含量最大的37 kD和不同菌株共有的28 kD這兩種外膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)序,匹配得到的外膜蛋白分別為ompF和ompK,以這兩種外膜蛋白作為嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的進(jìn)一步研究對(duì)象。以嗜水氣單胞菌的總DNA作為模板,分別構(gòu)建pET-32a-ompF和pET-32a-ompK兩種原核表達(dá)質(zhì)粒,制備得到高純度的r-ompF和r-ompK。Western-blot證實(shí)兩種重組蛋白都具有抗原性。分別用所制備的嗜水氣單胞菌的重組蛋白r-ompF和r-ompK作為免疫原,腹腔注射免疫歐洲鰻鱺。在免疫后的第1h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h和10 d分別采取歐洲鰻鱺的肝臟組織,進(jìn)行RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)三個(gè)免疫相關(guān)基因(IRF3、IgMa1和IgMb1)的mRNA表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),r-ompF和r-ompK對(duì)于歐洲鰻鱺的三個(gè)免疫相關(guān)基因都具有上調(diào)作用,其中r-ompK上調(diào)幅度明顯更大。在免疫后的第15d對(duì)歐洲鰻鱺進(jìn)行嗜水氣單胞菌活菌攻毒處理,評(píng)價(jià)r-ompF和r-ompK的免疫保護(hù)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),r-ompF蛋白對(duì)歐洲鰻鱺的相對(duì)免疫保護(hù)率為35.3%,而r-ompK蛋白提供的相對(duì)免疫保護(hù)率可以達(dá)到70.0%。綜合兩種重組蛋白對(duì)歐洲鰻鱺的免疫保護(hù)效果和對(duì)其肝臟組織中三種免疫相關(guān)基因的調(diào)控作用的比較,本研究發(fā)現(xiàn)重組外膜蛋白r-ompK更適合于作為嗜水氣單胞菌亞單位疫苗的候選成分。
【圖文】：

Ｆｏｌｈｉ－酚法測(cè)得所提取外膜蛋白的含量為２．１邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑３．２菌株外膜蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圖譜逡逑菌株３２２Ａ外膜蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ圖譜如圖１所示，菌株外膜蛋白條帶有逡逑１３條，其中主要條帶有９條，分子量分別為１０３、４５、４３、３７、３３、２８、２０、１８逡逑和１６邋ｋＤ，另有一些較為模糊的條帶，如６７、５４、５０和３９邋ｋＤ。逡逑１３逡逑

以嗜水氣單胞菌的總ＤＮＡ作模板，，采用設(shè)計(jì)的引物對(duì)外膜蛋白ｏｍｐＦ和逡逑ｏｐｍＫ的基因片段分別進(jìn)行ＰＣＲ的擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物采用１％的瓊脂糖凝膠逡逑電泳進(jìn)行分析，得到的電泳圖片能夠看到明顯的特異性條帶。其中圖５可以看到逡逑ｏｍｐＦ的ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物為９８０邋ｂｐ左右，圖６可以看到ｏｍｐＫ的ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物為逡逑８１０邋ｂｐ左右，片段長(zhǎng)度符合己經(jīng)發(fā)表的基因片段長(zhǎng)度。逡逑１邋２逡逑２Ｑ00ｂｐ—逡逑ｉ000ｂｐ—｜５＾：媜逡逑７５０ｂｐ——逡逑：二

本文編號(hào)：2700598