【摘要】：MicroRNA(miRNA)作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要手段,廣泛參與生物體多種生理過程的調(diào)控。在病原與宿主的博弈過程中,miRNA同樣扮演著重要角色。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)了大量免疫調(diào)控相關(guān)的牙鲆miRNAs。在此基礎(chǔ)上,本研究鑒定了兩條參與遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)感染過程的牙鲆miRNAs,pol-miR-194a和pol-miR-3p-2,并探索了二者的調(diào)控機(jī)制及在E.tarda感染過程中的免疫調(diào)控作用。我們首先檢測(cè)了pol-miR-194a對(duì)E.tarda感染的響應(yīng)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法,發(fā)現(xiàn)在E.tarda感染24 h后,牙鲆的肝臟、脾臟和鰓中pol-miR-194a的表達(dá)量均顯著上調(diào)。利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)pol-miR-194a能夠與干擾素調(diào)節(jié)因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)的3’UTR相互作用,表明IRF7是pol-miR-194a的一個(gè)靶基因。同時(shí),通過對(duì)IRF7靶序列及pol-miR-194a種子序列的突變實(shí)驗(yàn),證明了pol-miR-194a與IRF7-3’UTR的相互作用依賴于完整的種子序列。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在牙鲆鰓細(xì)胞系FG-9307細(xì)胞中過表達(dá)pol-miR-194a后,內(nèi)源性IRF7的蛋白表達(dá)水平顯著降低。為了驗(yàn)證pol-miR-194a對(duì)IRF7下游信號(hào)通路的調(diào)控,將pol-miR-194a mimic(pol-miR-194a模擬物)和I型干擾素的啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到FG-9307細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)pol-miR-194a mimic能夠顯著抑制I型干擾素啟動(dòng)子的活性。通過體外過表達(dá)實(shí)驗(yàn)和胞內(nèi)復(fù)制實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)pol-miR-194a能夠增強(qiáng)E.tarda在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。以上實(shí)驗(yàn)表明,pol-miR-194a表達(dá)受E.tarda調(diào)控,而pol-miR-194a下調(diào)牙鲆IRF7和I型干擾素的表達(dá),進(jìn)而降低牙鲆的抗感染免疫應(yīng)答,最終促進(jìn)E.tarda的胞內(nèi)復(fù)制。自噬在多種生理過程中發(fā)揮重要作用,如生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)以及病原感染與宿主的免疫調(diào)控等。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)E.tarda感染能夠誘導(dǎo)牙鲆脾臟免疫細(xì)胞和牙鲆FG-9307細(xì)胞系的自噬現(xiàn)象。p53在自噬過程中發(fā)揮著重要作用,同時(shí)被預(yù)測(cè)為牙鲆pol-miR-3p-2的靶基因。利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在E.tarda感染24 h后,牙鲆的肝臟、脾臟和鰓中pol-miR-3p-2的表達(dá)量均顯著上調(diào)。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和western blot分析,我們確認(rèn)p53是pol-miR-3p-2的靶基因。在FG-9307細(xì)胞中過表達(dá)pol-miR-3p-2能夠激活細(xì)胞自噬。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在FG-9307細(xì)胞中敲降p53后,自噬關(guān)鍵蛋白Beclin的表達(dá)水平上調(diào);在HEK293T細(xì)胞中異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)p53敲降能夠上調(diào)Beclin的表達(dá)。通過體外過表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)合胞內(nèi)復(fù)制實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)pol-miR-3p-2能夠抑制E.tarda的胞內(nèi)復(fù)制。以上結(jié)果表明,E.tarda感染能夠促進(jìn)pol-miR-3p-2的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)p53蛋白表達(dá),并上調(diào)Beclin的表達(dá),從而促進(jìn)牙鲆免疫細(xì)胞發(fā)生自噬,抑制E.tarda的胞內(nèi)復(fù)制。綜上所述,我們闡釋了兩條牙鲆miRNAs,pol-miR-194a和pol-miR-3p-2,的調(diào)控機(jī)制,并揭示了二者在E.tarda感染過程中的作用。這些研究結(jié)果促進(jìn)了我們對(duì)魚類miRNAs作用機(jī)制以及E.tarda感染機(jī)制的理解。
【圖文】：

E. tarda 通常先侵染上皮細(xì)胞和腸上皮組織（圖1.1）。在某些情況下，E. tarda 能夠侵染到宿主更深的部位，被吞噬細(xì)胞攝入。在生存環(huán)境的選擇上，E. tarda 更傾向于在宿主細(xì)胞內(nèi)生活，如上皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，以更好地逃避宿主天然免疫系統(tǒng)的殺傷，利于自身存活和增殖 (Leung etal., 2012b)。在感染的開始，E. tarda 利用其鞭毛靠近和接觸宿主上皮細(xì)胞（如

參與多種生理過程的調(diào)控。在過去的二十年間，，越和致病過程，都發(fā)現(xiàn)了 miRNAs 的參與 (Chandra 2016)。據(jù)估計(jì)，大概 60%的人類蛋白編碼基因受et al., 2008)。因可以編碼單個(gè) miRNA 或者兩個(gè)及以上的 miRNA自于命名為 primary-microRNA（pri-miRNA）的初2004)。pri-miRNAs 在核 RNAse III 核糖核酸內(nèi)切酶大概在 70 個(gè)堿基的中間產(chǎn)物，命名為 pre-miRNA質(zhì) RNAse III 內(nèi)切酶（Dicer 酶）的作用下，形成雙為 22 個(gè)堿基左右的成熟 miRNAs （圖 1.2）。在 miRNA 雙鏈中的一條參與形成 RNA 介導(dǎo)的silencing complex，RISC），介導(dǎo) RISC 靶向目的 m (Tomari et al., 2007)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2697995