【摘要】：類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)廣泛分布于水環(huán)境和動(dòng)物體,是一種人、獸以及多種水生動(dòng)物的腸道病原菌,可通過(guò)水、魚(yú)及貝類感染給人,可引起人類感染性腹瀉和食物中毒。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一種常見(jiàn)的條件致病菌,其對(duì)魚(yú)類也能感染致病,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成很大威脅。目前類志賀鄰單胞菌、肺炎克雷伯菌的檢測(cè)方法大都依賴專業(yè)技術(shù)人員操作和昂貴的儀器設(shè)備,限制了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖基層快速診斷的應(yīng)用。因此,建立快速、簡(jiǎn)便的類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌檢測(cè)技術(shù)已成為了未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。本研究建立了依賴鈣黃綠素和核酸試紙條的可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),以利于在水產(chǎn)養(yǎng)殖基層分別對(duì)類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌檢測(cè)。主要內(nèi)容如下:1.分別從發(fā)病雜交鱧和烏鱧病灶處分離到菌株FS170522和ZS685683,經(jīng)過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定、16S rDNA基因序列分析,進(jìn)一步構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定菌株FS170522為類志賀鄰單胞菌,菌株ZS685683為肺炎克雷伯菌。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株FS170522對(duì)供試的雜交鱧有較強(qiáng)致病性,LD_(50)為7.5×10~4 CFU/g。菌株ZS685683可致健康烏鱧患病,且人工感染癥狀與自然感染相同,并從人工感染患病烏鱧體內(nèi)再次分離到該病原菌,LD_(50)為1.4×10~5 CFU/g。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示:菌株FS170522對(duì)氨芐西林和頭孢拉定等抗生素耐藥;菌株ZS685683對(duì)復(fù)方新諾明、克林霉素、麥迪霉素、哌拉西林等抗生素耐藥。2.以類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌為研究對(duì)象,根據(jù)GenBank上注冊(cè)的類志賀鄰單胞菌hugA基因序列和肺炎克雷伯菌FimK基因序列,采用LAMP在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4及Lasergene7.0 Primer Select進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)及篩選。分別hugA基因重組質(zhì)粒和FimK基因重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模板,將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)同鈣黃綠素做熒光指示相結(jié)合,優(yōu)化反應(yīng)溫度和時(shí)間及反應(yīng)體系,分別建立了類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌可視化LAMP快速檢測(cè)方法;同時(shí),結(jié)合核酸試紙條檢測(cè)技術(shù),分別實(shí)現(xiàn)了針對(duì)這兩種病原菌的LAMP核酸試紙條檢測(cè)。研究結(jié)果表明,針對(duì)類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌分別建立的兩種LAMP檢測(cè)方法特異性強(qiáng),且能在64℃下50 min內(nèi)完成DNA擴(kuò)增,鈣黃綠素可視化LAMP及其核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)針對(duì)靶基因的檢測(cè)下限均為20拷貝/反應(yīng)(copies/reaction),比傳統(tǒng)PCR敏感100倍。進(jìn)一步應(yīng)用建立的兩種方法對(duì)臨床病料進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,可視化LAMP及其核酸試紙條方法對(duì)臨床疑似病料的檢出率均高于普通PCR的檢出率。本研究分別建立的鈣黃綠素可視化LMAP及其核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)中。
【圖文】：

圖 1-2 全封閉式靶核酸擴(kuò)增快速檢測(cè)裝置條技術(shù)的應(yīng)用67]把polyT與polyA特異性配對(duì)以及生物素一親和素色作用相結(jié)合，，并首次應(yīng)用于免疫層析試紙條上。試紙條技術(shù)并證明該技術(shù)具有較強(qiáng)特異性及較高的測(cè)到特定的分子標(biāo)簽，并且在樣品添加 2 min 后立肉及肉制品中鴨源成分快速檢測(cè)的 PCR 可視化性。田卓等[70]指出 PCR-核酸試紙條方法是一種既疫學(xué)檢測(cè)的特異性好的特點(diǎn)，同時(shí)操作簡(jiǎn)便的快速的目的與意義

圖 2-1 菌株 FS170522 菌落形態(tài) 圖 2-2 菌株 FS170522 革蘭氏染色結(jié)果 1000×圖 2-3 菌株 ZS685683 菌落形態(tài) 圖 2-4 菌株 ZS685683 革蘭氏染色結(jié)果 1000×2.2.2 分離菌生理生化特性鑒定根據(jù)《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[75]和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手
【學(xué)位授予單位】：佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S941.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2696441