【摘要】：類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)廣泛分布于水環(huán)境和動物體,是一種人、獸以及多種水生動物的腸道病原菌,可通過水、魚及貝類感染給人,可引起人類感染性腹瀉和食物中毒。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一種常見的條件致病菌,其對魚類也能感染致病,對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成很大威脅。目前類志賀鄰單胞菌、肺炎克雷伯菌的檢測方法大都依賴專業(yè)技術(shù)人員操作和昂貴的儀器設(shè)備,限制了其在水產(chǎn)養(yǎng)殖基層快速診斷的應用。因此,建立快速、簡便的類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌檢測技術(shù)已成為了未來的發(fā)展趨勢。本研究建立了依賴鈣黃綠素和核酸試紙條的可視化環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),以利于在水產(chǎn)養(yǎng)殖基層分別對類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌檢測。主要內(nèi)容如下:1.分別從發(fā)病雜交鱧和烏鱧病灶處分離到菌株FS170522和ZS685683,經(jīng)過細菌形態(tài)學、生理生化鑒定、16S rDNA基因序列分析,進一步構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌株FS170522為類志賀鄰單胞菌,菌株ZS685683為肺炎克雷伯菌。人工感染試驗結(jié)果顯示,菌株FS170522對供試的雜交鱧有較強致病性,LD_(50)為7.5×10~4 CFU/g。菌株ZS685683可致健康烏鱧患病,且人工感染癥狀與自然感染相同,并從人工感染患病烏鱧體內(nèi)再次分離到該病原菌,LD_(50)為1.4×10~5 CFU/g。藥敏試驗結(jié)果顯示:菌株FS170522對氨芐西林和頭孢拉定等抗生素耐藥;菌株ZS685683對復方新諾明、克林霉素、麥迪霉素、哌拉西林等抗生素耐藥。2.以類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌為研究對象,根據(jù)GenBank上注冊的類志賀鄰單胞菌hugA基因序列和肺炎克雷伯菌FimK基因序列,采用LAMP在線引物設(shè)計軟件Primer Explorer V4及Lasergene7.0 Primer Select進行了引物設(shè)計及篩選。分別hugA基因重組質(zhì)粒和FimK基因重組質(zhì)粒作為標準DNA模板,將環(huán)介導等溫擴增技術(shù)同鈣黃綠素做熒光指示相結(jié)合,優(yōu)化反應溫度和時間及反應體系,分別建立了類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌可視化LAMP快速檢測方法;同時,結(jié)合核酸試紙條檢測技術(shù),分別實現(xiàn)了針對這兩種病原菌的LAMP核酸試紙條檢測。研究結(jié)果表明,針對類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌分別建立的兩種LAMP檢測方法特異性強,且能在64℃下50 min內(nèi)完成DNA擴增,鈣黃綠素可視化LAMP及其核酸試紙條檢測技術(shù)針對靶基因的檢測下限均為20拷貝/反應(copies/reaction),比傳統(tǒng)PCR敏感100倍。進一步應用建立的兩種方法對臨床病料進行檢測,結(jié)果表明,可視化LAMP及其核酸試紙條方法對臨床疑似病料的檢出率均高于普通PCR的檢出率。本研究分別建立的鈣黃綠素可視化LMAP及其核酸試紙條檢測技術(shù)具有操作簡單、檢測快速準確、檢測成本低等優(yōu)點,可應用于類志賀鄰單胞菌和肺炎克雷伯菌的現(xiàn)場快速檢測中。
【圖文】：

圖 1-2 全封閉式靶核酸擴增快速檢測裝置條技術(shù)的應用67]把polyT與polyA特異性配對以及生物素一親和素色作用相結(jié)合，，并首次應用于免疫層析試紙條上。試紙條技術(shù)并證明該技術(shù)具有較強特異性及較高的測到特定的分子標簽，并且在樣品添加 2 min 后立肉及肉制品中鴨源成分快速檢測的 PCR 可視化性。田卓等[70]指出 PCR-核酸試紙條方法是一種既疫學檢測的特異性好的特點，同時操作簡便的快速的目的與意義

圖 2-1 菌株 FS170522 菌落形態(tài) 圖 2-2 菌株 FS170522 革蘭氏染色結(jié)果 1000×圖 2-3 菌株 ZS685683 菌落形態(tài) 圖 2-4 菌株 ZS685683 革蘭氏染色結(jié)果 1000×2.2.2 分離菌生理生化特性鑒定根據(jù)《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[75]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手
【學位授予單位】：佛山科學技術(shù)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S941.4

【參考文獻】

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本文編號：2696441