【摘要】：本研究采用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了凡納濱對(duì)蝦腸道組織的全長(zhǎng)cDNA文庫,經(jīng)電子拼接和序列比對(duì)分析獲得了凡納濱對(duì)蝦圍食膜蛋白基因(Peritrophin)全長(zhǎng)序列,該基因包含一個(gè)長(zhǎng)度為828bp的開放閱讀框(open reading frame, ORF),編碼275個(gè)氨基酸,理論分子質(zhì)量約30.782 kDa。進(jìn)一步對(duì)所獲得的序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示該序列與斑節(jié)對(duì)蝦的相似性77.3%,與短溝對(duì)蝦的相似性為76.1%,與中國對(duì)蝦的相似性為72.2%,與墨吉對(duì)蝦的相似性為62.3%。根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取一段保守的凡納濱對(duì)蝦圍食膜蛋白基因(L.vannamei Peritrophin, LvPT)序列進(jìn)行后續(xù)蛋白功能研究,LvPT序列長(zhǎng)為687bp,編碼228個(gè)氨基酸,理論分子質(zhì)量約25.829kDa。根據(jù)IHHNV福建株(GenBank NC_002190.2)的序列,設(shè)計(jì)開放閱讀框CP、NS1和NS2的融合表達(dá)載體引物,并構(gòu)建酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1、pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT;酵母穿梭質(zhì)粒經(jīng)DDO/X/A檢測(cè)無自激活現(xiàn)象后用于蛋白互作研究。將重組菌株Y2HGold (pGBKT7-CP, pGBKT7-NS1, pGBKT7-NS2)分別和重組菌株Y187 (pGADT7-LvPT)融合mating,經(jīng)DDO/X/A初步篩選發(fā)現(xiàn)均有相互作用,經(jīng)QDO/X/A篩選發(fā)現(xiàn)pGBKT7-CP和pGADT7-LvPT, pGBKT7-NS1和pGADT7-LvPT存在較強(qiáng)的相互作用,而pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT之間的作用較弱,懷疑其為假陽性。由此可見,LvPT蛋白與IHHNV病毒間產(chǎn)生相互作用,而且有可能直接影響病毒侵襲機(jī)體的過程。此外,我們采用RNAi的方法,體外合成dsLvPT后,進(jìn)行體內(nèi)注射干擾LvPT基因的表達(dá),研究IHHNV病毒在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)復(fù)制是否受到抑制。結(jié)果表明,注射dsLvPT后,LvPT表達(dá)下調(diào),IHHNV病毒的相對(duì)拷貝數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低。進(jìn)一步說明LvPT與IHHNV病毒感染凡納濱對(duì)蝦的機(jī)制有關(guān)。此外,我們通過western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LvPT可以在High-Five昆蟲細(xì)胞中表達(dá),為進(jìn)一步研究LvPT與IHHNV病毒編碼的蛋白間的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S945.49

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本文編號(hào)：2695066