發(fā)布時間：2020-06-03 16:06

【摘要】：本研究采用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了凡納濱對蝦腸道組織的全長cDNA文庫,經(jīng)電子拼接和序列比對分析獲得了凡納濱對蝦圍食膜蛋白基因(Peritrophin)全長序列,該基因包含一個長度為828bp的開放閱讀框(open reading frame, ORF),編碼275個氨基酸,理論分子質(zhì)量約30.782 kDa。進一步對所獲得的序列進行比對分析,結(jié)果顯示該序列與斑節(jié)對蝦的相似性77.3%,與短溝對蝦的相似性為76.1%,與中國對蝦的相似性為72.2%,與墨吉對蝦的相似性為62.3%。根據(jù)比對結(jié)果選取一段保守的凡納濱對蝦圍食膜蛋白基因(L.vannamei Peritrophin, LvPT)序列進行后續(xù)蛋白功能研究,LvPT序列長為687bp,編碼228個氨基酸,理論分子質(zhì)量約25.829kDa。根據(jù)IHHNV福建株(GenBank NC_002190.2)的序列,設計開放閱讀框CP、NS1和NS2的融合表達載體引物,并構(gòu)建酵母穿梭表達質(zhì)粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1、pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT;酵母穿梭質(zhì)粒經(jīng)DDO/X/A檢測無自激活現(xiàn)象后用于蛋白互作研究。將重組菌株Y2HGold (pGBKT7-CP, pGBKT7-NS1, pGBKT7-NS2)分別和重組菌株Y187 (pGADT7-LvPT)融合mating,經(jīng)DDO/X/A初步篩選發(fā)現(xiàn)均有相互作用,經(jīng)QDO/X/A篩選發(fā)現(xiàn)pGBKT7-CP和pGADT7-LvPT, pGBKT7-NS1和pGADT7-LvPT存在較強的相互作用,而pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT之間的作用較弱,懷疑其為假陽性。由此可見,LvPT蛋白與IHHNV病毒間產(chǎn)生相互作用,而且有可能直接影響病毒侵襲機體的過程。此外,我們采用RNAi的方法,體外合成dsLvPT后,進行體內(nèi)注射干擾LvPT基因的表達,研究IHHNV病毒在凡納濱對蝦體內(nèi)復制是否受到抑制。結(jié)果表明,注射dsLvPT后,LvPT表達下調(diào),IHHNV病毒的相對拷貝數(shù)與對照組相比顯著降低。進一步說明LvPT與IHHNV病毒感染凡納濱對蝦的機制有關(guān)。此外,我們通過western-blot檢測發(fā)現(xiàn)LvPT可以在High-Five昆蟲細胞中表達,為進一步研究LvPT與IHHNV病毒編碼的蛋白間的相互作用機制奠定了基礎。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S945.49

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本文編號：2695066