【摘要】：鯉科魚類是我國傳統(tǒng)的養(yǎng)殖品種,養(yǎng)殖產(chǎn)量大,是人們餐桌上的美味佳肴。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,各種類型的傳染病不斷地發(fā)生和流行,對水產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)引起的鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp,SVC)是對鯉科魚類危害最大的傳染病之一。由于病毒宿主范圍廣,病原極易擴散流行,因此SVC被世界動物衛(wèi)生組織(Office International des Epizooties,OIE)規(guī)定為必須申報的動物疫病之一,而我國在新頒布的動物疫病名錄中將其列為一類動物疫病。目前,尚無任何有效控制該病的藥物、疫苗或其他方法,國際上通行的防控措施是對SVC進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)控,及早發(fā)現(xiàn)病魚并進(jìn)行隔離、撲殺,從而達(dá)到阻斷該病暴發(fā)流行的趨勢。本研究以全新合成的香豆素類化合物為研究對象,利用體外細(xì)胞分子水平篩選模型對化合物進(jìn)行抗病毒活性評價,得到具有良好抗SVCV活性的香豆素。實驗通過觀察SVCV感染和藥物處理后EPC(Epithelioma papulosum cyprini)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和各項生化指標(biāo)的變化,以及使用多種細(xì)胞凋亡檢測技術(shù),對活性香豆素的抗SVCV活性作了進(jìn)一步深入的研究。與此同時,本研究探索了兩種抗病毒香豆素對SVCV感染細(xì)胞過程的影響和對宿主抗病毒反應(yīng)的作用,以期為開發(fā)水產(chǎn)抗SVCV專用藥物及SVC的防控提供理論基礎(chǔ)。本研究取得結(jié)果如下:1.香豆素類化合物離體抗SVCV活性研究以49種香豆素類化合物為研究對象,通過實時定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測SVCV G蛋白表達(dá)情況,體外篩選出的4種香豆素對SVCV增殖的抑制率超過90%,即7-[3-(苯并咪唑)丙氧基]香豆素(B4)、7-[4-(4-甲基咪唑)丁氧基]香豆素(C2)、7-[4-(苯并咪唑)丁氧基]香豆素(C4)和7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素(D5)。藥物構(gòu)效關(guān)系說明:不同取代基的咪唑類香豆素的抗SVCV活性要優(yōu)于其他種類的化合物,其中,苯并咪唑和甲基咪唑取代基對化合物抗病毒活性貢獻(xiàn)最大。細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞活力檢測顯示上述4種香豆素顯著地減弱了SVCV引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),并可維持EPC細(xì)胞生長活力,有效保護細(xì)胞免受病毒損傷。而相比之下,香豆素C4、D5處理感染SVCV的細(xì)胞后在72 h以內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞活力保護效應(yīng)優(yōu)于另外兩種抗病毒香豆素B4和C2,因此,被選為后續(xù)實驗的研究對象。藥物濃度梯度實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)香豆素C4、D5對SVCV的N、P和M蛋白相對表達(dá)的最高抑制率同樣超過90%,并在較短時間內(nèi)快速進(jìn)入細(xì)胞,一定時間內(nèi)維持較高的胞內(nèi)藥物濃度。2.香豆素C4、D5抗SVCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究通過細(xì)胞熒光染色、掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SVCV感染誘導(dǎo)EPC細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡特征,包括細(xì)胞核皺縮、細(xì)胞形態(tài)斷裂、凋亡小體產(chǎn)生以及細(xì)胞骨架崩解等,我們證實SVCV可誘導(dǎo)EPC細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,而香豆素C4、D5則有效抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明,SVCV感染EPC細(xì)胞48 h后,導(dǎo)致超過52%的EPC細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡;隨著病毒感染時間的增長,細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加,達(dá)到63.2%。而在加入香豆素C4、D5后,藥物處理組的細(xì)胞凋亡率明顯降低,正常細(xì)胞的比例超過80%,已接近對照組水平。另外,研究發(fā)現(xiàn)隨著C4、D5濃度的增加,藥物處理組的細(xì)胞凋亡率持續(xù)下降,藥物濃度與細(xì)胞凋亡率之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Caspase酶活性檢測結(jié)果反映出香豆素C4、D5可有效控制SVCV誘導(dǎo)Caspase凋亡信號的啟動,避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3.香豆素C4通過PKC-Nrf2/ARE通路抗SVCV研究通過測定香豆素C4對PKC-Nrf2/ARE通路活化的影響,探究該化合物的抗SVCV作用機制。實驗結(jié)果顯示,C4顯著提高胞內(nèi)SOD和CAT酶活性以及GSH含量,保護細(xì)胞免受SVCV造成的氧化損傷。另外,香豆素C4在不同程度上提高了PKCαThr638和PKCβSer660兩個位點的磷酸化水平,從而激活Nrf2 Ser40位點的磷酸化,導(dǎo)致Nrf2入核蛋白量接近對照組的4倍,最終啟動Nrf2/ARE抗SVCV通路。RNA干擾結(jié)果顯示Nrf2/ARE通路的下游靶基因HO-1能夠影響干擾素基因表達(dá);而C4不僅可以顯著提高HO-1基因的表達(dá),同樣對干擾素基因表達(dá)有促進(jìn)作用。因此,香豆素C4的抗SVCV機制主要是利用PKCα/β兩個亞基的磷酸化作用調(diào)控Nrf2/ARE通路促進(jìn)HO-1表達(dá),進(jìn)而觸發(fā)干擾素產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)。4.香豆素D5對SVCV G蛋白功能的作用研究通過研究香豆素D5對SVCV增殖的影響,發(fā)現(xiàn)該化合物在病毒感染前期干擾SVCV識別EPC細(xì)胞,抑制RNA由晚期內(nèi)吞泡釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),最終發(fā)揮藥物抗病毒作用。超速離心實驗結(jié)果顯示:在D5與SVCV粒子混合4 h后,SVCV G蛋白的擴增效率下降約90%,病毒滴度由10~(6.5±0.1)減小到10~(3.4±0.2),這說明D5可能對SVCV G蛋白結(jié)構(gòu)造成一定破壞,從而降低病毒前期感染力和增殖力。通過構(gòu)建SVCV G蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)D5有效地抑制pEGFP-SVCV G質(zhì)粒在EPC細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),這個結(jié)果從另一方面證明了D5可以特異性作用于SVCV G蛋白,對G蛋白表達(dá)、功能產(chǎn)生影響。此外,香豆素D5顯著地抑制Erk1/2的磷酸化作用,以激活A(yù)kt-mTor通路,減少EPC細(xì)胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量,降低SVCV誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平,對SVCV在EPC細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和病毒粒子的釋放產(chǎn)生抑制作用。5.香豆素C4、D5在體抗SVCV活性研究通過注射方式研究香豆素C4、D5對斑馬魚死亡率和魚體內(nèi)病毒含量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C4處理組斑馬魚的累積死亡率相對病毒組減少17.5%,D5處理組減少20%。斑馬魚脾臟和腎臟內(nèi)SVCV G蛋白表達(dá)結(jié)果顯示第1天和第4天魚體內(nèi)G蛋白的表達(dá)低于病毒組,反應(yīng)了香豆素C4/D5的抗病毒作用。與此同時,這兩種香豆素提高了斑馬魚體內(nèi)的抗氧化酶活性,維持抗氧化-氧化系統(tǒng)平衡,并在SVCV復(fù)制前期通過激活魚體干擾素表達(dá)對病毒增殖產(chǎn)生一定的抑制作用,最終降低SVCV對斑馬魚感染力。由此可見,香豆素C4和D5可以作為抗SVCV感染潛在的備選藥物。綜上所述,香豆素C4、D5分別通過宿主抗病毒反應(yīng)和直接作用病毒結(jié)構(gòu)蛋白對SVCV增殖產(chǎn)生強烈的抑制作用,能夠在體外和體內(nèi)顯著地降低病毒量,有效地維持宿主細(xì)胞生長活力,減少感染病毒斑馬魚的死亡率。因此,香豆素C4、D5對防控SVC具有廣闊的應(yīng)用前景。
【圖文】：

析對先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾進(jìn)而產(chǎn)生擁有自主知識產(chǎn)權(quán)型植物源藥物的研究熱點，具有非常重要的經(jīng)濟和社會意界動物衛(wèi)生組織（Office international des épizooties，OIE一（Ashraf et al. 2016），我國農(nóng)業(yè)部所發(fā)布的《一、二、 SVC 列為一類動物疫病。SVC 通常在春季爆發(fā)，，并引起anellosetal.2006）。起初 SVC 主要流行于東歐和中歐國家。隨著水產(chǎn)貿(mào)易的快速發(fā)展和魚類新品種的引進(jìn)，目前北流行（Ahneetal.2002；Dikkeboometal.2004；Fijan1999；Te我國尚未有該病大規(guī)模爆發(fā)的報道，但已從患病的金魚、出 SVCV（Liu et al. 2004）。理變化

而研發(fā)的滅活苗和弱毒苗在魚體內(nèi)雖然能產(chǎn)生一定足，如造價高、保護力不強以及安全性低等。新興的 DNA優(yōu)點，成本低、易生產(chǎn)和儲存；而多價苗將多個編碼抗原的建質(zhì)粒，能夠高效率的抗多種病害。當(dāng)前在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，疫苗已顯示出良好的應(yīng)用價值，但至今無 SVCV 新型疫苗員認(rèn)為今后需要為水產(chǎn)疫苗的發(fā)展建立一套可靈活應(yīng)用的模力、安全性和是否能通過當(dāng)?shù)氐姆ㄒ?guī)、符合當(dāng)?shù)亓餍胁W(xué)情開發(fā) SVCV 疫苗（包括活苗、滅活苗、亞單位苗和核酸苗） et al. 2016）。究進(jìn)展特征A
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943

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本文編號：2692015