【摘要】：Dnmt1基因是DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶編碼基因的一種,該基因編碼DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1),該酶對(duì)DNA甲基化的發(fā)生以及維持有著重要作用。MeCP2基因是DNA甲基CpG結(jié)合蛋白編碼基因的一種,該基因編碼甲基CpG結(jié)合蛋白2,該蛋白是神經(jīng)細(xì)胞正常發(fā)育所必須的,并能與DNMT1蛋白相互作用共同維持DNA甲基化狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)室課題組在以往的魚類雜交育種研究中,利用紅鯽(RCC)作為母本,湘江野鯉鯉(CC)作為父本,進(jìn)行屬間遠(yuǎn)緣雜交,成功培育出了世界上首例兩性可育的異源四倍體鯽鯉雜交品系,目前已經(jīng)形成遺傳穩(wěn)定的異源四倍體鯽鯉(4nAT)群體并成功繁殖了25代(F3-F25)。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室課題組還利用雄性異源四倍體鯽鯉與雌性二倍體紅鯽雜交,得到了不育的異源三倍體鯽魚(3n)。該三倍體、四倍體鯽鯉的形成為我們研究不同倍性魚的分子遺傳學(xué)特征以及表觀遺傳學(xué)特征提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)材料。在雜交與多倍體化過程中,表觀遺傳效應(yīng)對(duì)生物體的基因表達(dá)與表型特征起著重要的調(diào)控作用。甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的最主要方式,對(duì)4nAT,3n及其親本雌性RCC和雄性CC編碼甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT1)以及甲基Cp G結(jié)合蛋白2(MeCP2)的兩個(gè)基因的開放閱讀框進(jìn)行序列分析,并對(duì)兩個(gè)基因在不同倍性魚的不同組織、不同胚胎發(fā)育時(shí)期以及性腺發(fā)育不同時(shí)期進(jìn)行表達(dá)研究,對(duì)探討異源四倍體鯽鯉,三倍體鯽鯉與其親本dna甲基化差異有著重要意義。在實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究的基礎(chǔ)上,本文對(duì)dnmt1與mecp2基因進(jìn)行了開放閱讀框序列克隆及氨基酸序列分析,同時(shí)比較分析了這兩個(gè)基因在不同倍性魚中的表達(dá)水平,為進(jìn)一步從表觀遺傳學(xué)角度探討3n的不育性特征與基因表達(dá)量的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本論文的研究結(jié)果如下:1.對(duì)cc、rcc、3n和4natdnmt1基因與mecp2基因的開放閱讀框序列進(jìn)行克隆,發(fā)現(xiàn)dnmt1基因在rcc,3n和4nat中都存在兩種類型:dnmt1-α與dnmt1-β;而cc中該基因只有一種類型;其中,rcc的dnmt1-α與dnmt1-β開放閱讀框長(zhǎng)度分別為4512bp和4521bp,分別編碼1503個(gè)氨基酸殘基和1506個(gè)氨基酸殘基。ccdnmt1基因其開放閱讀框長(zhǎng)度為4512bp,共編碼了1503個(gè)氨基酸殘基。3ndnmt1-α與dnmt1-β開放閱讀框長(zhǎng)度都為4527bp,編碼1508個(gè)氨基酸殘基。4natdnmt1-α與dnmt1-β開放閱讀框長(zhǎng)度分別為4512bp與4506bp,各編碼1503、1501個(gè)氨基酸殘基。而mecp2基因在cc、3n和4nat中存在兩種類型,mecp2-α與mecp2-β,而rcc中該基因只有一種類型;rcc該基因開放閱讀框全長(zhǎng)為1635bp,編碼544個(gè)氨基酸;cc的mecp2-α與mecp2-β開放閱讀框全長(zhǎng)度分別為1638bp和1623bp,分別編碼545和540個(gè)氨基酸殘基。3n兩種類型mecp2-α與mecp2-β開放閱讀框序列長(zhǎng)度分別為1623bp和1632bp,分別編碼540和543個(gè)氨基酸殘基。4nat的兩種類型mecp2-α與mecp2-β開放閱讀框序列長(zhǎng)度分別為1623bp和1638bp,分別編碼540和545個(gè)氨基酸殘基。通過對(duì)比分析4nat、3n及其父母本dnmt1基因和mecp2基因開放閱讀框序列,發(fā)現(xiàn)兩種多倍體雜合子兩個(gè)基因編碼區(qū)都發(fā)生了插入、重組等變異。2.采用rt-pcr的方法比較分析dnmt1基因在四種魚不同組織中的mrna表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在四種魚的肌肉,腦,心臟,肝臟,脾臟,腎臟,卵巢和精巢組織中,都有dnmt1基因的表達(dá)信號(hào),但是在腦組織和性腺組織中,其mrna表達(dá)量相對(duì)較高,而在肌肉組織中mrna表達(dá)量最低。同樣地,采用rt-pcr與q-pcr的方法比較分析dnmt1基因在四種魚胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育多細(xì)胞期至囊胚早期dnmt1基因mrna表達(dá)水平較高,隨著胚胎的繼續(xù)發(fā)育,dnmt1基因表達(dá)水平呈顯著降低,原腸胚期后維持低水平狀態(tài)。同時(shí),通過比較研究四種魚dnmt1基因在繁殖期與非繁殖期性腺中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)不同時(shí)期,dnmt1基因在卵巢中的表達(dá)均比精巢中表達(dá)高,并且,在不育3n中,dnmt1基因的表達(dá)量低于可育rcc和4nat,而四種魚精巢中dnmt1基因的表達(dá)沒有顯著差異,該結(jié)果表明dnmt1基因與卵巢的發(fā)育密切相關(guān)。3.采用rt-pcr的方法比較分析mecp2基因在四種魚不同組織中的mrna表達(dá)情況與dnmt1基因表達(dá)結(jié)果相似,mecp2基因在四種魚的肌肉,腦,心臟,肝臟,脾臟,腎臟,卵巢和精巢中均有表達(dá),且在腦組織中的表達(dá)量最高,而性腺中表達(dá)量較高。采用rt-pcr的方法以及q-pcr,比較分析mecp2基因在四種魚胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育時(shí)期多細(xì)胞期至囊胚早期mecp2基因mrna表達(dá)水平較高,到原腸胚后表達(dá)量下降,然后維持低表達(dá)水平直到出膜期。這也與Dnmt1基因在胚胎發(fā)育不同時(shí)期的結(jié)果相似。進(jìn)一步的,通過比較研究四種魚性腺在繁殖期與非繁殖期MeCP2基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在四種魚中,MeCP2基因在繁殖期的表達(dá)都要低于非繁殖期;并且MeCP2基因在3n卵巢中的表達(dá)量水平明顯高于RCC和4nAT卵巢表達(dá)水平,而在精巢中的表達(dá)量隨魚的倍性增加而增加,說明該基因的表達(dá)與不同倍性魚的卵巢發(fā)育有著緊密聯(lián)系。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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