【摘要】：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體,是茶多酚生物活性的主要成份。本實(shí)驗(yàn)以草魚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探索以濃度為75mg/kg的EGCG灌胃草魚后,在不同時(shí)間點(diǎn)分析魚血漿及組織樣品中兒茶素的代謝規(guī)律。此外,我們還比較了四種兒茶素:表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素(EC)體外抑制草魚致病菌嗜水氣單胞菌、銅綠假單胞菌和檸檬酸桿菌的功效研究。結(jié)論如下:(1)建立了草魚血漿和組織樣品的前處理方法。分別準(zhǔn)確吸取0.6mL血漿、2m L肝勻漿液于10mL具塞離心管中,均加入為40μL的20%的Vc以及200μL的0.05%Na2-EDTA溶液,混勻后,再準(zhǔn)確加入乙酸乙酯4m L,振蕩5min,6000r/min高速離心5min,取出全部上層有機(jī)相;再加入2mL乙酸乙酯重復(fù)萃取一次,合并兩次萃取的有機(jī)相于尖底玻璃離心管中,45℃水浴中弱氮?dú)饬鞔蹈?向血漿樣品中加入500uL10%的乙腈-水溶液,振蕩溶解,18000r/min高速離心5min后,吸取上清液20μL進(jìn)樣分析。肝臟組織萃取液揮干后用500uL的10%乙腈-水溶解,然后再加入0.5mL正己烷去脂,振蕩后,18000r/min高速離心5min后,棄去全部正己烷層,0.5mL正己烷重復(fù)去脂一次,高速離心后取下層20μL進(jìn)樣分析。(2)運(yùn)用HPLC檢測(cè)分析血液、肝臟中的EGCG的含量,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行含量測(cè)定,作出EGCG在血清、肝臟中吸收代謝的濃度-時(shí)間曲線圖。灌胃之后,分別于15min、30min、45min、60min、120min和300min六個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集魚血液樣品。經(jīng)與EGCG標(biāo)品、空白樣品對(duì)照,灌胃后15-300min血清中均能檢測(cè)到EGCG原型,且15-45min時(shí)間范圍內(nèi),隨著時(shí)間推移,血漿中EGCG的濃度不斷上升,45min時(shí)達(dá)到最大濃度。達(dá)峰時(shí)間Tmax為45min,最大濃度Cmax為512.8068ug/mL,在此濃度下,計(jì)算得到的相對(duì)生物利用度為5.57%,60-300min隨之緩慢下降。(3)同樣,15-300min時(shí)間范圍內(nèi)的肝臟樣品中也均能檢測(cè)到EGCG原型,在15-60min時(shí)間范圍內(nèi),隨著時(shí)間推移,EGCG濃度不斷增加,灌胃后60minEGCG達(dá)到最大濃度Cmax434.1476ug/mL,達(dá)峰時(shí)間Tmax為60min。(4)運(yùn)用UPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS對(duì)樣品組織進(jìn)行分析檢測(cè),結(jié)果表明,15-300min時(shí)間范圍內(nèi)在血清、肝臟和腸道組織樣品中均能檢測(cè)到EGCG原型,在時(shí)間點(diǎn)為30min的肝臟樣品中檢測(cè)到ECG的存在,60-300min時(shí)間范圍在血清、肝臟和腸道組織樣品中均檢測(cè)到EGCG代謝產(chǎn)物ECG的存在。(5)通過一系列遞增濃度的兒茶素溶液對(duì)四種菌液的抑菌試驗(yàn)研究可知,四種兒茶素對(duì)四種菌大腸桿菌44102、檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌和嗜水氣單胞菌均有不同程度的抑菌效果,低濃度的藥液(0.05-0.4mM)的抑制作用屬于低敏;中濃度的藥液(0.4-2.0mM)的抑制作用屬于中敏;高濃度的藥液(2.0-10mM)的抑制作用屬于高敏。0.05mM為MIC(最低抑菌濃度),當(dāng)藥液濃度由0.2mM增加到4.0mM時(shí),抑菌圈的增幅較大,抑菌效果增強(qiáng)的幅度較為明顯;當(dāng)藥液濃度由4.0mM增加到10.0mM時(shí),抑菌圈增幅較小,抑菌效果增強(qiáng)的幅度較小,抑菌效果逐漸達(dá)到上限�？傮w來看,隨著藥液濃度的增加,抑菌圈直徑呈增長趨勢(shì),即抑菌強(qiáng)度隨藥液濃度增加而增加。同一濃度的藥液對(duì)不同菌的抑制作用不同。EGCG對(duì)三種強(qiáng)致病菌嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌和銅綠假單胞菌抑菌效果強(qiáng)于非致病菌大腸桿菌44102,其中,檸檬酸桿菌被抑菌效果最強(qiáng)。并且,EGCG的抑菌效果強(qiáng)于其余三種兒茶素,EGCGEGCECGEC。
【圖文】：

2.2 主要研究內(nèi)容（1）建立了魚血漿和組織樣品中 EGCG 的前處理方法。（2）運(yùn)用 HPLC 檢測(cè)分析不同時(shí)間點(diǎn)血液、肝臟中的 EGCG 的吸收及代謝規(guī)律制濃度-時(shí)間曲線。（3）UPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS 確定血清、肝臟、腸道組織中 EGCG 的代謝產(chǎn)（4）比較四種兒茶素 EGCG、EGC、ECG、EC 對(duì)草魚致病菌嗜水氣單胞菌、銅單胞菌和檸檬酸桿菌抑菌功效的研究。（5）草魚腸道內(nèi)容物體外抑菌效果的研究。2.3 技術(shù)路線（圖 2-1）

6000r/min離心10min，提取上清液。合并兩次上清液，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00μL10%乙腈-水復(fù)溶，然后過0.22μm有機(jī)相濾膜進(jìn)液相。兩種方法處理的血清樣品進(jìn)樣后的HPLC分析圖如圖3-1所示。圖 3-1 血清前處理方法的比較Fig.3-1 The comparison of plasam pretreatment method通過圖3-1比較分析可知，方法二出峰效果較好，故方法二比方法一萃取所得目標(biāo)成分的效果好。方法二液液萃取用的有機(jī)試劑是乙酸乙酯，方法一用的是甲醇。方法二中，我們加入了抗氧化成分抗壞血酸及金屬螯合劑Na2-EDTA從而起到了保護(hù)目標(biāo)物的作用，且要加大原液量，方法一中我們選用的200μL血清樣品，在二中我們?cè)黾拥?00μL，并且增加復(fù)溶次數(shù)，，這都更加有利于我們對(duì)目標(biāo)成分的檢測(cè)。（3）HPLC梯度洗脫條件的探究和改進(jìn)HPLC洗脫條件一：A相為0.2%甲酸水，B相乙腈
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S948

【引證文獻(xiàn)】

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1 吳新楷;茶多酚的消毒特性及對(duì)大腸桿菌的作用機(jī)理研究[D];北京建筑大學(xué);2018年

2 鞠安琪;表達(dá)維氏氣單胞菌Malt基因重組干酪乳桿菌的構(gòu)建及口服免疫學(xué)研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 梁高楊;氧化油脂對(duì)斑點(diǎn)叉尾洶、羅非魚生長、抗氧化和腸道健康的影響及茶多酚的干預(yù)作用[D];上海海洋大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2686107