【摘要】：本文以我國鲆鰈類主導(dǎo)養(yǎng)殖種類—半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)為研究對象,運用成熟肽克隆、原核表達(dá)、Western blotting和組織離體孵育等技術(shù)手段成功構(gòu)建了半滑舌鰨MCH1和MCH2體外原核表達(dá)系統(tǒng),得到了純化的具有生物活性的體外重組蛋白;通過光學(xué)顯微鏡觀察、電鏡觀察、統(tǒng)計學(xué)、分子生物學(xué)等方面的研究手段,在組織形態(tài)、血清學(xué)、mRNA水平上對池塘養(yǎng)殖牙鲆無眼側(cè)黑化消褪的原因及機理進(jìn)行初步探究。研究結(jié)果可為養(yǎng)殖鲆鰈類無眼側(cè)黑化的機制研究提供理論與技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:1.半滑舌鰨黑色素聚集激素(MCH1)的原核表達(dá)及生物活性分析根據(jù)半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)MCH1的cDNA序列設(shè)計特異性引物擴(kuò)增成熟肽片段,利用原核表達(dá)載體pET-32a成功構(gòu)建了重組MCH1/pET32a質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生重組蛋白。半滑舌鰨MCH1重組蛋白大小為29.9KD,32℃條件下以0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h時重組蛋白表達(dá)量最高,占菌體總蛋白的50%。Western blotting免疫印跡表明MCH1重組蛋白可被6×His抗體特異性識別。經(jīng)Ni2+-NTA親和柱純化,可獲得高純度的MCH1重組蛋白。采用垂體離體孵育方法測試蛋白活性,MCH1重組蛋白可有效刺激或抑制垂體MCH和MSH肽的分泌,MCH肽水平先上升后下降,在100nmol/L達(dá)到峰值,MSH肽水平顯著升高。隨著外源MCH1重組蛋白濃度的增加,垂體MCH1和MCH2 mRNA表達(dá)都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,POMC-a和PACAP mRNA表達(dá)都呈現(xiàn)明顯下降趨勢,而POMC-b、MCHR1、MCHR2、MITF基本沒有變化,表明獲得的半滑舌鰨MCH1重組蛋白具有調(diào)節(jié)垂體激素分泌和基因表達(dá)的生理功能。研究結(jié)果可為研制半滑舌鰨無眼側(cè)黑化調(diào)控的專用生物制劑提供理論與技術(shù)依據(jù)。2.半滑舌鰨黑色素聚集激素(MCH2)的原核表達(dá)及生物活性分析根據(jù)半滑舌鰨MCH2的cDNA序列設(shè)計特異性引物擴(kuò)增成熟肽片段,利用原核表達(dá)載體pET-32a成功構(gòu)建了重組MCH2/pET32a質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生重組蛋白。半滑舌鰨MCH2重組蛋白大小為32.1KD,27℃條件下以0.2mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h時表達(dá)量最高,占菌體總蛋白的55%。Western blotting免疫印跡表明MCH2重組蛋白可被6×His抗體特異性識別。經(jīng)Ni2+-NTA親和柱純化,可獲得高純度的MCH2重組蛋白。采用垂體離體孵育方法測試蛋白活性,MCH2重組蛋白可有效刺激垂體MCH和MSH肽的分泌,孵育液中MCH肽水平顯著升高,在1000nmol/L達(dá)到峰值,MSH肽水平在1000nmol/L才開始顯著升高。隨著外源MCH2重組蛋白濃度的增加,垂體MCH1和MCH2 mRNA表達(dá)都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,POMC-a和PACAP mRNA表達(dá)都呈現(xiàn)明顯升高趨勢,而POMC-b表達(dá)卻呈現(xiàn)明顯下降趨勢,同時MCHR1、MCHR2、MITF基本沒有變化,表明獲得的半滑舌鰨MCH2重組蛋白具有調(diào)節(jié)垂體激素分泌和基因表達(dá)的生理功能。3.池塘養(yǎng)殖牙鲆無眼側(cè)體色黑化消褪機理初步研究養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn),無眼側(cè)發(fā)生黑化的牙鲆在池塘養(yǎng)殖一段時間后,其無眼側(cè)黑化程度呈現(xiàn)出逐步消退直到正常。針對這種池塘養(yǎng)殖牙鲆無眼側(cè)黑化消褪的現(xiàn)象,我們從形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和mRNA水平上對其可能的生理學(xué)機制進(jìn)行了研究。形態(tài)學(xué)觀察表明,牙鲆無眼側(cè)黑化消褪區(qū)域的黑色素細(xì)胞數(shù)量顯著少于有眼側(cè)和無眼側(cè)黑化消褪區(qū)域,無眼側(cè)黑化消褪過程中黑化區(qū)域的鱗片類型經(jīng)歷了櫛鱗→弱櫛鱗→圓鱗逐漸轉(zhuǎn)變的過程。隨著無眼側(cè)黑化的減弱,櫛鱗上硬棘數(shù)量也隨之減少。測定了無眼側(cè)黑化、無眼側(cè)正常和無眼側(cè)發(fā)生消褪的牙鲆血清中兩種體色相關(guān)肽,結(jié)果發(fā)現(xiàn)無眼側(cè)黑化消褪的牙鲆血清中MCH肽的含量顯著高于其他兩種牙鲆。同時無眼側(cè)皮膚黑化的牙鲆血清中MSH肽的含量顯著高于其他兩種類型的牙鲆。基因表達(dá)分析表明,無眼側(cè)黑化消褪魚垂體MCH mRNA表達(dá)水平顯著高于無眼側(cè)黑化魚,而垂體POMC1 mRNA表達(dá)水平顯著低于無眼側(cè)黑化魚,都與無眼側(cè)正常魚無顯著差異。無眼側(cè)黑化消褪魚腦MCH mRNA表達(dá)水平與無眼側(cè)黑化魚無顯著差異,但顯著低于無眼側(cè)正常魚。無眼側(cè)黑化消褪魚POMC1mRNA表達(dá)水平顯著低于其他兩種魚,無眼側(cè)正常魚和黑化魚無顯著差異。研究結(jié)果可為建立池塘養(yǎng)殖牙鲆無眼側(cè)黑化消褪的調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。
【圖文】：

行 5 倍梯度稀釋成 6 個標(biāo)準(zhǔn)0.85<E<1.1。行三次平行試驗，每次試驗增特異性，每次試驗均設(shè)置空基因的相對表達(dá)量[75]。.0 版本)統(tǒng)計，對激素表達(dá)水OVA)，設(shè)置差異顯著性水平較使用 SPSS(17.0 版本)進(jìn)行的構(gòu)建熟肽序列連接到表達(dá)質(zhì)粒 腸桿菌 BL21 中，菌液 PC析可知目的基因插入完全正

13圖 2-2 半滑舌鰨 MCH1 重組成熟肽序列注:陰影部分為起始密碼子 ATG，*表示終止密碼子 TAA，雙下劃線部分為 6×His tag，方框表示限制性內(nèi)切酶位點 BamH I、Hind IIIFig.2-2 The matured peptide sequence of MCH1 of Cynoglossus semilaevisNotes: The initiation codon (ATG) is shaded.The stop codon(TAA) is marked by asterisk. The6×His tag is double underlined. The endonuclease BamH I and Hind III are boxed2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌 BL21(DE3)中的表達(dá)將重組質(zhì)粒MCH1/pET-32a進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)得到的MCH1重組菌在25kD和 30kD 之間出現(xiàn)特異性條帶，，此條帶為 MCH1 重組蛋白，大小為 29.9kD。由圖可以看出，重組菌蛋白表達(dá)量在不同的條件下存在明顯差異，得到重組表達(dá)的最優(yōu)條件為 32℃、IPTG(0.2mmol/L)誘導(dǎo)培養(yǎng) 6h。重組蛋白表達(dá)量經(jīng)測定占細(xì)菌總蛋白的 50%(圖 2-3,2-4,2-5)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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1 朱學(xué)武;養(yǎng)殖鲆鰈類無眼側(cè)黑化調(diào)控機制研究[D];上海海洋大學(xué);2016年

本文編號：2684255