【摘要】：殺魚愛德華氏菌(Edwardsiella piscicida)是一種胞內(nèi)腸道致病菌,宿主非常廣泛,能感染魚類、兩棲類、爬行動物類、鳥類和哺乳動物甚至人類。殺魚愛德華氏菌不僅能感染上皮細胞,也能抵抗吞噬體的吞噬活性,在動物體內(nèi)引起嚴重的疾病。殺魚愛德華氏菌引起的愛德華病在魚類中表現(xiàn)得比較明顯,這些魚類包括藍曼龍魚(Blue gourami fish),大菱鲆(Turbot)以及斑馬魚(Zebrafish)。殺魚愛德華氏菌自身有兩套與致病型密切相關(guān)的分泌系統(tǒng),分別是三型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system,T3SS)和六型分泌系統(tǒng)(Type Ⅵsecretion system,T6SS)。在感染過程中,殺魚愛德華菌會通過T3SS或者T6SS向宿主細胞注射毒力因子。這些毒力因子能影響宿主細胞中各種信號通路,使細菌在宿主體內(nèi)更好地生存和增殖。三型分泌系統(tǒng)對沙門氏菌(Salmonella enterica)、耶爾森氏菌(Yersinia spp.)和志賀氏桿菌(Shigella spp.)等大多數(shù)病原菌來說是非常重要的。在侵染過程中,病原菌利用T3SS將效應(yīng)物蛋白注射到宿主細胞內(nèi),發(fā)揮調(diào)節(jié)宿主細胞的功能,達到利于細菌生存的目的。對于殺魚愛德華氏菌,T3SS是最重要的毒力系統(tǒng)之一,能幫助殺魚愛德華氏菌在宿主細胞中生存和增殖,而更多時候T3SS是通過向宿主細胞中注射效應(yīng)物蛋白來發(fā)揮功效的。因此,鑒定新的殺魚愛德華氏菌T3SS效應(yīng)物蛋白就顯得非常重要,能幫助我們更好地了解宿主與病原菌之間的相互作用。在本課題中,我們以動物細胞作為研究模型,鑒定到一個新的殺魚愛德華氏菌T3SS效應(yīng)物蛋白EseK。該蛋白由基因ETAE_1586編碼。EseK依賴T3SS途徑被分泌到細菌胞外上清和被注射到宿主細胞內(nèi),定位于宿主細胞的膜組分中。在EseK的分泌過程中,EseK的N端20個氨基酸起到分泌信號肽的功能。在對EseK進行功能研究時,我們發(fā)現(xiàn)EseK不僅可以抑制宿主細胞中MAPKs信號通路的p38、JNK和ERK1/2的磷酸化,而且能抑制宿主細胞中細胞因子TNF-α的表達。在細菌中,T3SS效應(yīng)物蛋白通常會伴隨著一個不能被分泌的分子伴侶蛋白存在,分子伴侶通常情況下會在T3SS效應(yīng)物蛋白的表達、分泌或轉(zhuǎn)運中起到幫助作用。在本課題中,我們通過生物信息學分析結(jié)合細菌分泌實驗、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運實驗以及體外表達蛋白純化并做Pull-down實驗,證實由基因ETAE_1587和ETAE_1588編碼的兩個蛋白EscH和EscS是T3SS效應(yīng)物蛋白EseK的Ⅰ類分子伴侶蛋白。它們都能幫助EseK分泌至細菌培養(yǎng)上清和轉(zhuǎn)運至宿主細胞中,但是對EseK的表達和降解沒有影響。體外Pull-down實驗表明EseK與EscH以及EseK與EscS都能直接相互作用,三種蛋白能形成一種以EseK蛋白作為接頭蛋白的三聯(lián)體復(fù)合物。通過對蛋白進行截斷分析,進一步研究相互作用的蛋白關(guān)鍵區(qū)段,我們發(fā)現(xiàn)EscS蛋白N端的10-21氨基酸區(qū)段對EscS結(jié)合到EseK蛋白上起到重要的作用,而EscH蛋白截斷后的N端部分和C端部分都對結(jié)合EseK蛋白起作用。對效應(yīng)物蛋白EseK來說,N端的73-89氨基酸區(qū)段能作為一個分子伴侶結(jié)合區(qū)段(Chaperone-binding domain,CBD)與分子伴侶蛋白EscH和EscS直接相互作用。最后,斑馬魚活體實驗表明,T3SS效應(yīng)物EseK以及它的兩個分子伴侶蛋白EscH和EscS都能幫助殺魚愛德華氏菌在斑馬魚的肝臟和腎臟中進行定植,都對細菌發(fā)揮毒力起到一定的作用。
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第２頁邐華東理工大學博士學位激酶（ＭＡＰ３Ｋｓ）、ＭＡＰＫ激酶（ＭＡＰ２ＫＳ或者ＭＫＫｓ）以及ＭＡＰＫ。有時，在級聯(lián)反除了這種三層的蛋白激酶之外，還有額外的兩個蛋白激酶參與其中，分別是ＭＡＰ３ＫＳ上游的ＭＡＰ４Ｋ以及處于ＭＡＰＫ下游的ＭＡＰＫＡＰＫ�？傮w來說，ＭＡＰＫ反應(yīng)過程是：當細胞受體接收到外界刺激信號時，將該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至ＭＡＰ３Ｋｓ，ＭＡＰ３是絲氨酸／蘇氨酸激酶，在真核細胞中大量存在，轉(zhuǎn)導(dǎo)至ＭＡＰ３ＫＳ的信號會引起ＭＡＰ３的磷酸化，使ＭＡＰ３ＫＳ自身得到活化。活化后的ＭＡＰ３ＫＳ能夠磷酸化其下游ＭＡＰ２的兩個絲氨酸／蘇氨酸殘基（Ｓ／Ｔ－ＸＸＸＸＸ－Ｓ／Ｔ，Ｘ指任意氨基酸），激活ＭＡＰ２Ｋｓ。ＭＡＰ是ＭＡＰＫ的激酶，是一種雙特異性的蛋白激酶。它被ＭＡＰ３ＫＳ磷酸化而被激活的是它本身的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ發(fā)生磷酸化。被磷酸化的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ位于ＭＡＰ２ＫＳ亞結(jié)構(gòu)域ＶＩＩＩ活化ｌｏｏｐ環(huán)中。在這個ｌｏｏｐ環(huán)上，該Ｓｅｒ／Ｔｈｒ以一種保守的三肽基（Ｓｅｒ－Ｘ－Ｔｈｒ）形式［７，８］逡逑0逡逑

華東理工大學博士學位論文逡逑端激酶（ＪＮＫ）邋１，２和３邋（ＪＮＫ１，ＪＮＫ２和ＪＮＫ３）。ＥＲＫ、ＪＮＫ以及ｐ３８的異構(gòu)體分類是根逡逑據(jù)它們的活性基體、結(jié)構(gòu)以及功能來進行的（圖１．３）［２，３］。逡逑Ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒｓ邐Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｖｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邐Ｓｔｒｅｓｓ逡逑價邋不ｃ邋ｖ逡逑－咖酬丨＿＿＿逡逑？邐？？，邋S緬義賢跡保沖澹停粒校誦藕磐芳蚧煎義希疲椋紓澹保沖澹櫻椋恚穡歟椋媯椋澹溴澹停粒校隋澹螅椋紓睿幔歟椋睿玨澹穡幔簦瑁鰨幔螅澹ǎ粒╁澹牛遙耍保插澹穡幔簦瑁鰨幔澹ǎ攏╁澹穡常稿澹幔澹穡澹擔澹幔睿溴澹澹穡幔簦瑁鰨幔螅澹ǎ茫╁義希剩危隋澹�，２邋ａｎｄ邋_澹穡幔簦瑁鰨幔螅常義習廡藕諾鶻詡っ福牛遙耍笫怯桑牛遙耍螅焙停牛遙耍螅擦礁齷蟣嗦氳摹＃牛遙耍蟮某稍卞義希牛遙耍螅卞搴灣澹牛遙耍螅插逡脖懷莆澹停粒校耍螅沖澹ǎ穡矗矗停粒校耍┖灣澹停粒校耍螅卞澹ǎ穡矗玻停粒校耍�，，是哺乳动辶x銜鎦兇釹缺患ǖ降模停粒校耍螅郟福蕁Ｔ冢停粒校酥�，Ｅ＿b耍焙停牛遙耍彩欠淺Ｏ嗨頻牡鞍字剩義纖侵淶南嗨菩源锏攪隋澹罰擔ィ郟保牽蕁ｅ義嫌桑牛遙耍蟛斡氬⒁嫉模停粒校思讀藕磐煩莆牛遙思讀從�。该甲x從χ屑ゅ義匣釵鎘瀉芏啵熱縞ひ蜃�、激瞬G橢琢齷鄧酪蜃櫻ǎ裕危疲悖簦┘易宓拇傺仔韻赴蜃印⒉″義顯喙胤腫悠祝ǎ校粒停校螅┤綺≡⑸锏鬧嗵牽蹋校�、危险相关纺[悠祝ǎ模粒停校螅⒛讜蔥藻義銜Ｏ招藕湃綞鮒嘌不械難躉緣兔芏戎鞍祝ǎ蹋模蹋┖屯捶韁械哪蛩峋宓鵲齲郟福蕁ｅ義獻魑畛＜模停粒校耍

本文編號：2682480