【摘要】：谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是細(xì)胞中抗氧化系統(tǒng)的組成部分,主要功能是排除細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的氧自由基,從而保護(hù)生物體遺傳物質(zhì)的完整性、細(xì)胞膜的穩(wěn)定性等。水中動(dòng)物因缺少特異性的免疫,故其自身的天然免疫就尤為重要。最近一些年,很多實(shí)驗(yàn)已論證GPx參與水中生物抗氧化的過(guò)程。淇河鯽(Qihe crucian carp Carassius auratus)作為河南省獨(dú)有珍稀水商品,具有十分顯著的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,所以探究淇河鯽GPx基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及對(duì)病原菌的免疫響應(yīng)有助于我們理解GPx的生物學(xué)功能。本論文用淇河鯽做為研究的材料,提取淇河的鯽魚(yú)肝臟總RNA,運(yùn)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出GPx1和GPx4 cDNA的完整序列;利用qPCR技術(shù)分批檢測(cè)了GPx1在正常淇河鯽9種器官組織中的表達(dá)狀況及用嗜水氣單胞菌處理后其在肝、鰓、腎、脾和頭腎中的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果能幫助我們理解淇河鯽的抗氧化保護(hù)機(jī)理,同時(shí)給淇河鯽魚(yú)病防控提供理論基礎(chǔ)。根據(jù)已經(jīng)知道的序列,合成相應(yīng)的PCR引物,同時(shí)克隆出淇河鯽GPx1和GPx4中間保守的序列、3'-UTC和5'-UTC,通過(guò)拼接后分別得到889 bp和875 bp兩段cDNA完整序列。淇河鯽GPx1的開(kāi)放閱讀框(Open reading frame,ORF)為576 bp,翻譯191個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)淇河鯽GPx1的相對(duì)分子質(zhì)量是21.61KD,理論等電點(diǎn)為6.84。在酶催化中心里,Se結(jié)合位點(diǎn)是第158~160位密碼子編碼的半胱氨酸。兩個(gè)家族標(biāo)簽序列:65LGAPCNQF72、153WNFEKF158。淇河鯽GPx1無(wú)跨膜區(qū)與信號(hào)肽,是一種胞內(nèi)酶。淇河鯽GPx4的ORF共513 bp,翻譯170個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為19.31KD,理論等電點(diǎn)為7.64�；钚灾行牡腟e結(jié)合位點(diǎn)是第208~210位密碼子編碼的半胱氨酸。GPx4家族標(biāo)簽序列:71LGFPCNQF78、136WNFTKF141。同時(shí)將兩個(gè)基因的氨基酸全長(zhǎng)順序放在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)它們?cè)诓煌锓N中都有很強(qiáng)的保守性。運(yùn)用qPCR技術(shù)檢查淇河鯽魚(yú)9種器官組織(肝、心、肌肉、脾、腸、頭腎、卵巢、腎和鰓)中GPx1的mRNA表達(dá)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GPx1在各內(nèi)臟和組織中都有表達(dá),且其表達(dá)的大小存在差異。其中,肝中表達(dá)量最大,在鰓、頭腎、腎臟、心臟、腸、脾臟、卵巢和肌肉中的表達(dá)的量逐漸的減少。同時(shí)采用qPCR技術(shù)檢查了淇河的鯽胚胎發(fā)生各個(gè)階段的GPx1 mRNA表現(xiàn)情況,結(jié)果顯示,從受精到胚胎發(fā)育再到孵化破膜,GPx1 mRNA表達(dá)量逐漸升高。利用嗜水氣單胞菌對(duì)淇河鯽魚(yú)實(shí)施侵染實(shí)驗(yàn),采用qPCR技術(shù)檢測(cè)肝、鰓、腎、脾、頭腎中GPx1的mRNA在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h及48 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。結(jié)果表明,經(jīng)嗜水氣單胞菌侵染后,GPx1在各器官組織中的表達(dá)都呈現(xiàn)極顯著變化(p0.01**),其變化趨勢(shì)為:表達(dá)量先上調(diào),然后下降,在頭腎中還出現(xiàn)了再次上升的現(xiàn)象,而且都是在6 h達(dá)到最大表達(dá)量。但是在鰓中的GPx1 mRNA表達(dá)量處理組與對(duì)照組表達(dá)變化不顯著。這顯示淇河鯽GPx1可能在抗病原菌侵染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著十分重要的功能。結(jié)論:1.擴(kuò)增得到淇河鯽GPx1和GPx4 cDNA完整序列。淇河鯽GPx1 cDNA完整序列有889 bp能翻譯191個(gè)氨基酸;淇河鯽GPx4 cDNA完整序列有875 bp,能翻譯170個(gè)氨基酸。2.經(jīng)嗜水氣單胞菌侵染后,淇河鯽GPx1在腎、脾、頭腎和肝中的表現(xiàn)與對(duì)照組相比均有極其顯著性差異(p0.01**),這表明淇河鯽GPx1可能在淇河鯽抵抗病原菌感染的免疫過(guò)程中起著重要作用。3.胚胎發(fā)育階段的GPx1 mRNA表達(dá)逐漸升高,表明在淇河鯽胚胎發(fā)育階段和幼體發(fā)育階段,GPx1在魚(yú)體抗氧化和提高幼體存活率方面起重要作用。
【圖文】：

羅氏沼蝦GPx催化中心的Sec[23]

算 mRNA 所處的外界條件很適合翻譯，其表達(dá)序列對(duì)于真核生物 GPx 正常表達(dá)翻譯是不可或在真核生物翻譯過(guò)程中形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)有兩種，， Form 1 型目前發(fā)現(xiàn)的有凡納濱對(duì)蝦（Litopenae于 Form 2 型目前發(fā)現(xiàn)的有羅氏沼蝦硒代半胱氨有幾個(gè)序列會(huì)是高度保守的如圖中加粗的幾個(gè)堿圖 1-1 羅氏沼蝦 GPx 催化中心的 Sec[23]
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S943;S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2681093