【摘要】：石斑魚是一種含有高蛋白、低脂肪的上等食用魚,是我國人工養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)魚類。其中,石斑魚的主要養(yǎng)殖品種是珍珠龍膽石斑魚。珍珠龍膽石斑魚常因感染魚類病毒性神經(jīng)壞死病(viral nervous necrosis,VNN)而損失慘重。VNN是養(yǎng)殖魚類的常發(fā)病,其危害大,死亡率高達(dá)65-100%。隸屬于羅達(dá)病毒科(Nodaviridae),目前認(rèn)為其有四種基因型。通過病毒血清型研究表明,4種基因型外殼蛋白的254～256位氨基酸為主要抗原決定簇,說明外殼蛋白基因可以用作抗原基因。目前,由于沒有特效疫苗和特異藥物防治石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病,所以石斑魚苗養(yǎng)殖受到VNN的嚴(yán)重制約。而微藻能進(jìn)行光合作用,是最原始的初級(jí)生產(chǎn)者成員,也在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有巨大作用,特別在水產(chǎn)動(dòng)物的小苗階段。衣藻(Chlamydomonas)生長周期短、是水體中常見優(yōu)勢藻類,適生性強(qiáng),是幼魚的天然餌料。而外殼蛋白含抗原決定簇,可以作為抗原在餌料微藻中表達(dá),得到抗原蛋白,使得飼喂了轉(zhuǎn)病毒性神經(jīng)壞死病病毒外殼蛋白(NNVCP)基因衣藻的石斑魚持續(xù)獲得抗原免疫。因此,采用轉(zhuǎn)NNVCP基因衣藻來預(yù)防VNN具有廣闊的應(yīng)用前景。本論文從以下方面進(jìn)行研究:經(jīng)濟(jì)藻株的保種、分離純化和擴(kuò)培;構(gòu)建pCAMBIA1302-NNVCP重組載體;將重組載體采用玻璃珠轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入萊茵衣藻;并進(jìn)行不同種類,不同濃度的抗性篩選;隨后對篩選的藻株進(jìn)行DNA、RNA水平驗(yàn)證;收集海南省樂東縣某石斑魚養(yǎng)殖基地培育的珍珠龍膽石斑魚發(fā)病魚苗,對其初步確診斷為VNN;采用轉(zhuǎn)基因微藻混合飼料進(jìn)行預(yù)防石斑魚VNN實(shí)驗(yàn),其研究結(jié)果如下:1、經(jīng)濟(jì)藻株的保種、分離、純化和擴(kuò)培對六種經(jīng)濟(jì)藻株的液態(tài)不純藻株采用稀釋分離法進(jìn)行分離,成功分離純化出六種經(jīng)濟(jì)藻株液態(tài)純種;采用10、20、40、60、80、100 μg/ml濃度的氨芐青霉素,對其采用平板劃線法,成功在固體培養(yǎng)基上純化出鹽藻、海水小球藻、扁藻。并將純化的藻種分別用對應(yīng)的培養(yǎng)基進(jìn)行保種。采用逐步放大培養(yǎng)法,對3種經(jīng)濟(jì)藻株進(jìn)行液態(tài)擴(kuò)培,每次擴(kuò)培終體積為100 L,期間總共擴(kuò)培5次,總共擴(kuò)培經(jīng)濟(jì)藻株體積500L。本實(shí)驗(yàn)不僅增加了實(shí)驗(yàn)室藻株資源庫的種類,擴(kuò)培的藻株用于苗種企業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐,實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)研學(xué)的價(jià)值。2、重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化衣藻及篩選通過NCBI查找NNVCP基因與pCAMBIA1302載體重組,成功構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA1302-NNVCP。并將pCAMBIA1302-NNVCP真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入衣藻。對pCAMBIA1302-NNVCP轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行抗性篩選。結(jié)果顯示:pCAMBIA1302-NNVCP轉(zhuǎn)基因藻株分別通過含有潮霉素2、5、10、15 μg/ml TAP固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,篩選成功的藻株有42株,最終接種在含有10μg/ml潮霉素的固體TAP培養(yǎng)基。3、轉(zhuǎn)基因藻株的鑒定、保種、擴(kuò)培和采收對抗性篩選后的轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行鑒定,對其進(jìn)行DNA、RNA提取,并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示:在pCAMBIA1302-NNVCP藻株中,有26株呈陽性。將得到的26株轉(zhuǎn)基因藻株保種在含有對應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基,并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因藻液態(tài)擴(kuò)培,擴(kuò)培出pCAMBIA1302-NNVCP-14/15/16藻液質(zhì)量分別為60.2g、66.7g、69.2g、65.7g,為轉(zhuǎn)基因微藻預(yù)防石斑魚VNN提供實(shí)驗(yàn)材料。4、海南珍珠龍膽石斑魚苗VNN的初步診斷收集海南省樂東縣某石斑魚養(yǎng)殖基地培育的珍珠龍膽石斑魚發(fā)病魚苗。通過診斷,結(jié)果顯示:出現(xiàn)了典型VNN癥狀,對患病魚體進(jìn)行了寄生蟲學(xué)檢查,結(jié)果為陰性;采用RT-PCR方法、采用OIE推薦引物,VNN的PCR產(chǎn)物特異性片段大小為421 bp;采用細(xì)胞腫大病毒、虹彩病毒檢測引物,采用RT-PCR方法排除混合感染,以此初步診斷為VNN。在此之前,很少有報(bào)道VNN在冬季發(fā)生,因此本研究對深入探索VNN具有重要意義,并且為攻毒實(shí)驗(yàn)提供材料。5、轉(zhuǎn)基因微藻預(yù)防珍珠龍膽石斑魚VNN實(shí)驗(yàn)探究出兩種簡易自制轉(zhuǎn)基因工程微藻混合飼料的制作方法。連續(xù)十天喂食轉(zhuǎn)基因混合飼料后,進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。從分子水平、細(xì)胞學(xué)水平、生物學(xué)水平結(jié)果顯示:攻毒24小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組腦組織中VNN病毒外殼蛋白mRNA含量比飼料對照組分別下降了67.25%、36.61%、77.17%;攻毒24小時(shí)實(shí)驗(yàn)組腦組織空泡化數(shù)量比對照組少,空泡化病變比對照組輕微;實(shí)驗(yàn)組平均存活率比飼料對照組高出33.33%,表明轉(zhuǎn)NNVCP基因衣藻對預(yù)防石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病有一定的作用。
【圖文】：

鹽藻扁藻逡逑叫：逡逑圖２－２純化的杜氏鹽藻、亞心型扁藻、海水小球藻逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｓａｌｔ邋ａｌｇａｅ，邋ｐｉａｔｙｍｏｎａｓ邋ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ，邋ｍａｒｉｎｅ邋ｃｈｌｏｒｅｌｌａ逡逑采用逐步放大培養(yǎng)法，對海水小球藻、卵囊藻、牟氏角毛藻、微擬球藻進(jìn)行液態(tài)逡逑擴(kuò)培，每次擴(kuò)培終體積為１００邋Ｌ，期間總共擴(kuò)培５次，總共擴(kuò)培經(jīng)濟(jì)藻株體積５００邋Ｌ，逡逑得出牟氏角毛藻、海水小球藻、卵囊藻、微擬球藻四種藻種的開放式擴(kuò)培是可行的，，逡逑培養(yǎng)過程中應(yīng)該逐漸進(jìn)行開放，并且轉(zhuǎn)接比例不宜過大（丨：５－１：１０）。不僅增加了實(shí)逡逑驗(yàn)室藻株資源庫的種類，擴(kuò)培的藻株用于苗種企業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)研學(xué)的價(jià)值。逡逑角毛藻擴(kuò)繁過程邐一￣７逡逑ｔｉｌ邋１邐．邋一邋—逡逑■邋—－灥一邋＾

邐１０ＵＳＨ光照邐Ｉ邋＾逡逑Ｂ邐■}0逡逑圖２－３牟氏角毛藻的擴(kuò)繁過程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｅｘｐａｎｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｃｈａｃｔｏｃｃｒｏｓ逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S943

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2681086