【摘要】：脂類是魚類飼料中重要的營養(yǎng)素,高脂飼料導(dǎo)致黃顙魚腸道的脂肪沉積,但是潛在的機制仍不清楚。我們以黃顙魚腸道和腸上皮細胞為研究對象,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡介導(dǎo)飼料脂肪誘導(dǎo)的脂肪沉積的機制。研究結(jié)果如下:1高脂投喂導(dǎo)致黃顙魚腸道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、凋亡和脂質(zhì)沉積配制三組不同脂肪含量的飼料,脂肪水平分別為6.98%(低脂飼料),11.3%(適量脂飼料)和15.4%(高脂飼料),飼養(yǎng)黃顙魚8周。測定腸道甘油三脂含量、脂代謝酶活和脂代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞自噬和細胞凋亡的mRNA水平。與低脂組和適量組兩組,高脂組增加甘油三脂含量和脂代謝酶活(6PGD、ME、ICDH和FAS),上調(diào)許多關(guān)鍵基因的表達水平,包括脂肪合成相關(guān)基因(6pgd、acca、fas和srebp 1c)、脂肪分解基因(cpt1、accb、hsla和hslb)、脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白ifabp、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因(grp78、ire1、xbp1、traf2和atf 6)、自噬相關(guān)基因(atg1b、lc3a、lc3b和atg3)和凋亡相關(guān)基因(baxa、caspase 3a和caspase 3b)。這表明高脂飼料升高脂肪合成、脂肪分解和脂肪酸轉(zhuǎn)運,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活自噬和凋亡。2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)自噬與凋亡緩解脂肪酸誘導(dǎo)黃顙魚腸上皮細胞的脂質(zhì)沉積為了深入探討飼料脂肪影響黃顙魚腸道脂肪沉積的機制,將分離出的腸粘膜上皮細胞用抑制劑(3-甲基腺嘌呤(3-MA)、4-苯基丁酸(4-PBA)或Ac-DVED-CHO(AC))進行1小時預(yù)處理后,在對照溶液或不同濃度的脂肪酸中培養(yǎng)24小時。通過4-PBA預(yù)孵育,應(yīng)用免疫印跡、實時熒光定量、脂合成酶活測定、甘油三脂與脂肪酸含量測定等技術(shù),檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對脂肪酸誘導(dǎo)腸上皮細胞的脂肪沉積的影響;4-PBA預(yù)孵育腸上皮細胞,應(yīng)用實時熒光定量、流式細胞術(shù)、激光共聚焦、吖啶橙AO染色、caspase 3酶活測定和Annexin V-FITC/PI染色等技術(shù),檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬、凋亡的相互作用關(guān)系;3-MA預(yù)孵育腸上皮細胞,應(yīng)用流式細胞術(shù)、激光共聚焦顯微術(shù)與透射電鏡、吖啶橙AO染色、MDC與Lyso Tracker雙染、免疫印跡、實時熒光定量PCR、TG含量測定、BODIPY493/503染色、CPT1酶活測定及HSL與ATGL ELISA試劑盒等技術(shù),檢測自噬水平及自噬介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的脂噬水平;Ac-DVED-CHO(AC)預(yù)孵育腸上皮細胞,應(yīng)用免疫印跡、流式細胞術(shù)、激光共聚焦顯微術(shù)、Annexin V-FITC/PI染色、caspase 3酶活、實時熒光定量和TG含量及CPT1酶活測定的技術(shù),檢測凋亡水平及凋亡介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的β氧化水平。結(jié)果顯示,脂肪酸激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的脂肪沉積,以及自噬和凋亡的激活;自噬介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的脂噬發(fā)生。綜上所述,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的脂肪沉積,自噬和凋亡;自噬與凋亡介導(dǎo)脂肪酸誘導(dǎo)的脂噬與β氧化降低了脂肪沉積。脂肪酸上調(diào)脂肪生成、脂肪分解和脂肪酸轉(zhuǎn)運,誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,激活自噬和凋亡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬和凋亡在脂肪誘導(dǎo)的黃顙魚腸粘膜上皮細胞脂肪代謝變化中起著重要的調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

第一章 文獻綜述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究進展1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的信號通路研究進展內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是一種在真核細胞中具有重要生物合成和信號功能的細胞器網(wǎng)不僅是主要的細胞內(nèi) Ca2+儲存場所，與 Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)和 Ca2+介導(dǎo)的信號通路密關(guān)，而且它還為分泌或嵌入細胞質(zhì)膜蛋白質(zhì)的合成、折疊和修飾提供了環(huán)境，能夠調(diào)控脂質(zhì)代謝（Verkhratsky and Toescu 2003, Marciniak and Ron 2006）。各理和病理條件，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+耗盡（Fu et al 2011）、氧化應(yīng)激（He et al 200高脂膳食（Kammoun et al 2009b）等，可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊負荷和承載力的不平衡，這種情況稱為“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激”（Schr der and Kaufman 2005；Ronalter 2007）。

圖 1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路與細胞自噬關(guān)系示意圖（Verfaillie et al 2010）FIGURE 1.2 Crosstalk between UPR signalling pathways and autophagy (Verfaillie et al 2010)有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過多種途徑誘導(dǎo)細胞自噬，活化的 PERK，IRE1和 Ca2+濃度的升高都可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬（Kouroku et al 2007；Maria et al 2007）。Kouroku 等（2007）通過分子干擾試驗發(fā)現(xiàn)，，干擾 PERK-eIF2 通路的表達可以降低PolyQ72 誘導(dǎo)的自噬，這說明 PERK-eIF2 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的自噬中起著重要作用。Ogata 等（2006）發(fā)現(xiàn)，UPR 反應(yīng)中的 IRE1 途徑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬過程中起著重要作用。通過用衣霉素與胡蘿卜素處理，同時缺失了 PERK，IRE1 和 ATF6基因的 MEFs 片段，發(fā)現(xiàn)只有抑制 IRE1 途徑，自噬才會被降低。并同時發(fā)現(xiàn)了 IRE1通過細胞漿銜接蛋白 TRAF2 相互作用，激活 JNK 調(diào)節(jié)細胞自噬（Ogata et al 2006；Kouroku et al 2007；王叢叢 2014）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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本文編號：2680180