【摘要】：斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一,在世界上同樣占有重要的地位,在有關(guān)斑節(jié)對(duì)蝦的研究上,性腺發(fā)育調(diào)控的研究受到了眾多學(xué)者的關(guān)注。同時(shí),繼基因組學(xué)之后蛋白質(zhì)組學(xué)研究成為了分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,蛋白組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到養(yǎng)殖生物的分子生物學(xué)研究中。目前,有關(guān)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍較少,斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制不明確。所以本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)方法對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育時(shí)期卵巢進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步探明斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本研究以斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育時(shí)期卵巢為研究對(duì)象,采用雙向電泳技術(shù)對(duì)卵巢發(fā)育表達(dá)蛋白進(jìn)行分離并篩選出差異表達(dá)蛋白點(diǎn);然后對(duì)篩選得到的差異點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析,將質(zhì)譜結(jié)果結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已開展的斑節(jié)對(duì)蝦肝胰腺轉(zhuǎn)錄組篩選相關(guān)基因進(jìn)行克隆表達(dá);同時(shí)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出與卵巢發(fā)育相關(guān)的泛素融合蛋白基因片段Pm Ub S27、Pm Ub L40,進(jìn)行了克隆和在卵巢不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析,相關(guān)結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了適合于斑節(jié)對(duì)蝦卵巢組織蛋白的雙向電泳技術(shù)體系,得到了分辨率高、重復(fù)性好的斑節(jié)對(duì)蝦發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時(shí)期卵巢組織蛋白表達(dá)圖譜。(2)通過斑節(jié)對(duì)蝦卵巢組織蛋白表達(dá)圖譜研究了卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期蛋白質(zhì)表達(dá)的變化,結(jié)果顯示卵巢發(fā)育Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期蛋白質(zhì)分別獲得了4147、4125、3972個(gè)蛋白點(diǎn),其中Ⅱ、Ⅲ期表達(dá)差異蛋白點(diǎn)418個(gè),Ⅲ、Ⅳ期表達(dá)差異蛋白點(diǎn)460個(gè)。其中Ⅱ期到Ⅲ期相比有159個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),259個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào);Ⅲ期到Ⅳ期相比有181個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào),279個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)。同時(shí)在三個(gè)時(shí)期中共同表達(dá)且表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的蛋白點(diǎn)分別有19、146個(gè),從中選取了18個(gè)表達(dá)量差異2倍及以上的蛋白點(diǎn),成功鑒定出12種蛋白,其中上調(diào)蛋白有卵黃蛋白原、β-肌動(dòng)蛋白,表達(dá)下調(diào)的蛋白有血藍(lán)蛋白、吡咯啉-5-羧酸還原酶(delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase,mitochondrial,Pm P5CDh)、原肌球蛋白、前列腺素還原酶1、白介素結(jié)合增強(qiáng)因子3同系物x4亞型、肌動(dòng)蛋白1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,Pm GST)、β-微管蛋白、延長(zhǎng)因子1-α。(3)根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果,從鑒定的12種蛋白中篩選了線粒體吡咯啉-5-羧酸還原酶(Pm P5CDh)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Pm GST)進(jìn)行了研究,從m RNA水平檢測(cè)了Pm P5CDh和Pm GST在斑節(jié)對(duì)蝦不同組織中和卵巢發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)水平,結(jié)果顯示Pm P5CDh基因在斑節(jié)對(duì)蝦肌肉組織中表達(dá)量最高,其次為腦神經(jīng),在其他各組織中表達(dá)無顯著性差異。Pm GST基因在斑節(jié)對(duì)蝦精巢和血淋巴中表達(dá)量最高,其次為胸腹神經(jīng)、肝胰腺和卵巢。在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)中,Pm P5CDh基因呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn),在卵巢發(fā)育Ⅲ期表達(dá)量達(dá)到最高。Pm GST基因在卵巢發(fā)育過程中呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),但在Ⅳ期表達(dá)異常,表達(dá)量最小,在Ⅴ期達(dá)到最大值。(4)泛素融合蛋白Pm Ub S27、Pm Ub L40基因c DNA序列全長(zhǎng)分別為506bp、571bp,分別編碼154個(gè)、129個(gè)氨基酸的蛋白;在各組織中均有表達(dá)。兩個(gè)泛素核糖體蛋白是由氮末端的泛素結(jié)構(gòu)域和碳末端的核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域組成。實(shí)時(shí)定量結(jié)果顯示,Pm Ub S27基因在卵巢中表達(dá)量顯著高于其他組織,并且在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量最高。Pm Ub L40基因在肝胰腺中表達(dá)量最高,其次為肌肉和卵巢,且在卵巢發(fā)育Ⅱ期表達(dá)量最高。通過對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,初步探討了斑節(jié)對(duì)蝦不同發(fā)育時(shí)期蛋白的表達(dá)情況,并得到了卵巢發(fā)育調(diào)控相關(guān)的蛋白基因,表明這些基因?qū)τ诎吖?jié)對(duì)蝦卵巢的發(fā)育具有一定的作用,對(duì)進(jìn)一步闡明斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

中國(guó)對(duì)蝦卵巢結(jié)構(gòu)示意圖（孫修濤，1意卵巢結(jié)構(gòu) (b)示意卵巢第 6 側(cè)葉橫f the ovary of the female prawn Fenneropetructure of ovary (b)The sixth ovarian sid

圖 1.2 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本流程Fig.1.2 The basic process of protein mass spectrometry電噴霧電離質(zhì)譜將液相離子轉(zhuǎn)變?yōu)闅庀嚯x子而進(jìn)行 MS 分析。電噴霧電離電荷殘余原理[25-26]，是樣品溶液在電場(chǎng)及輔助氣流的作用下噴成霧狀帶揮發(fā)性溶液在高溫下逐漸蒸發(fā)，液滴表面的電荷體密度隨半徑的減小而增
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2680057