【摘要】：半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國重要的經(jīng)濟海水魚類,具有生長迅速、體積大、口味鮮美、營養(yǎng)成分豐富等優(yōu)良性狀,成為近年來一種優(yōu)良的養(yǎng)殖對象。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,各種傳染性疾病日益頻繁地發(fā)生,尤其是以哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染為主的細菌病,發(fā)病快,傳播迅速,給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來巨大沖擊。目前,多數(shù)養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中只能采用抗生素和化學藥品來防控和治療此類病害,不僅收效甚微,而且還會增加病原菌的抗藥性,嚴重污染水體環(huán)境,因此,從提高魚類本身的抗病能力出發(fā),對于半滑舌鰨免疫抗病分子機制的研究逐漸受到重視。本文運用分子生物學方法及基因工程技術,以半滑舌鰨中兩個免疫相關基因TGF-β1和TGF-β3為研究對象,開展了基因的性質(zhì)與功能的研究。探索了二者對半滑舌鰨免疫調(diào)節(jié)機制的影響規(guī)律,對于探索半滑舌鰨抗病分子機制以及抗病育種具有重要的理論意義;半滑舌鰨TGF-β1和TGF-β3蛋白的重組表達研究對于開發(fā)用于半滑舌鰨疾病防治的基因工程制劑等方面具有重要的應用價值。首先,本研究從半滑舌鰨肝臟中克隆獲得了TGF-β1基因。推導的TGF-β1氨基酸序列含有6個N端糖基化位點,一個整合素與其配體蛋白識別位點和一個TGF-β家族標簽。系統(tǒng)進化樹分析顯示,半滑舌鰨TGF-β1分別與斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)和海鯛(Sparus aurata)的TGF-β1親緣關系較為密切。實時熒光定量PCR結(jié)果表明,半滑舌鰨TGF-β1基因在健康魚的多個組織(心臟、腎臟、腸、肌肉、皮膚、腦、鰓、肝臟、脾臟)中均有表達,在皮膚中表達量最高,其次是腎臟,在肌肉中表達量最低。經(jīng)哈維氏弧菌感染后,TGF-β1在肝臟、脾臟和腎臟中呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢,在感染48h后的肝臟中表達量達到最大值,是對照0h組的3.17倍;在鰓中,TGF-β1表達量相對于對照0h組沒有顯著變化。同樣地,從半滑舌鰨肝臟中克隆獲得了TGF-β3基因。推導的TGF-β3氨基酸序列均含有3個N端糖基化位點和一個TGF-β家族標簽。系統(tǒng)進化樹分析顯示,半滑舌鰨TGF-β3分別與與紅鰭東方渶(Takifugu rubripes)和羅非魚(Oreochromis niloticus)的TGF-β3親緣關系較為密切。qRT-PCR結(jié)果表明,半滑舌鰨TGF-β3基因在健康魚的多個組織(心臟、腎臟、腸、肌肉、皮膚、腦、鰓、肝臟、脾臟)中也存在差異性表達,在皮膚中表達量最高,其次是腦,在肌肉中表達量最低。經(jīng)哈維氏弧菌感染后,TGF-β3在脾臟、腎臟和鰓中呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢,在感染24h后的鰓中表達量達到最大值,是對照0h組的4.71倍;在肝臟中,TGF-β3表達量相對于對照0h組沒有顯著變化。以上結(jié)果提示,TGF-β1和TGF-β3可能在半滑舌鰨抵御細菌感染的免疫中發(fā)揮了重要作用,并且在抗菌免疫過程中這二者之間可能存在復雜的相互作用機制。本研究為證明二者參與機體免疫調(diào)節(jié)提供了證據(jù),為半滑舌鰨分子免疫研究提供了理論依據(jù)。其次,利用PCR方法克隆獲得了帶有AvrII和NotI酶切位點的半滑舌鰨TGF-β1和TGF-β3基因,并將其插入分泌型表達載體pPIC9K中,成功構(gòu)建出重組表達載體。將質(zhì)粒線性化后電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株,GS115菌落PCR和測序驗證表明半滑舌鰨TGF-β1和TGF-β3已整合到畢赤酵母染色體上。經(jīng)G418抗性多拷貝篩選,獲得了可以在4mg/mL的G418抗性水平正常生長的多拷貝重組酵母菌株。添加甲醇對重組酵母菌株進行誘導表達,誘導表達的蛋白提取物通過SDS-PAGE和Western-Blot檢測分析,與空載體質(zhì)粒相比,TGF-β1和TGF-β3重組表達質(zhì)粒在標準Marker的45kD附近出現(xiàn)明顯蛋白條帶,與預期大小基本一致,表明半滑舌鰨TGF-β1和TGF-β3在畢赤酵母中得到正確表達。本研究實現(xiàn)了半滑舌鰨TGF-β1和TGF-β3基因在體外的重組表達,而且酵母表達的重組蛋白能夠直接分泌到培養(yǎng)基中,便于后期的純化以及大量制備。為進一步研究半滑舌鰨TGF-β1和TGF-β3基因的功能提供了資料,并為高效、簡便地生產(chǎn)可以提高半滑舌鰨免疫力和組織損傷修復能力的飼料添加劑奠定了基礎。
【圖文】：

上海海洋大學碩士學位論文化的 II 型受體結(jié)合形成異源四聚復合物，I 型受體能識別并結(jié)合這個異源四聚復合物。自動磷酸化的 II 型受體胞內(nèi)區(qū)的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域會轉(zhuǎn)磷酸化，將磷酸傳遞到 I 型受體胞內(nèi)區(qū) GS 結(jié)構(gòu)域中，將其絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，從而激活 I 型受體[71、72]。SARA 蛋白協(xié)助召集游離的 R-Smad 向受體聚集，并協(xié)助 R-Smad 錨定在受體上[73]。經(jīng)活化的 I 型受體通過其 GS 區(qū)與 R-Smad C 端保守域 MH2 結(jié)合，，并將R-Smad C 端 SSXS 結(jié)構(gòu)域中的兩個 Ser 殘基磷酸化[74]。R-Smad 改變構(gòu)象，與 I 型受 體 分 離 。 Co-Smad 能 識 別 R-Smad 磷 酸 化 的 MH2 結(jié) 構(gòu) 域 ， 并 與 之 形 成R-Smad-Co-Smad 異源多聚復合物，將信號進一步傳遞到核內(nèi)[75]。

24圖 2-1 半滑舌鰨 TGF-β1 與其它物種 TGF-β1 氨基酸序列比對Figure 2-1 Comparison of deduced amino acid sequences of TGF-β1 from half smooth tongue soleand other species注：“—”表示 N 糖基化位點，“...”表示整合素結(jié)合位點（RGD），“ ”表示 TGF-β家族標簽。黑色區(qū)域表示不同物種 TGF-β1 完全相同的氨基酸殘基，深灰色區(qū)域表示不同物種TGF-β1比較保守的氨基酸殘基，淺灰色區(qū)域表示不同物種TGF-β1保守性較弱的氨基酸殘基，“.”表示不同物種 TGF-β1 缺失的氨基酸殘基。Note:“—”denotes N-glycosylation site, “...”denotes integrin binding site, “ ”denotes TGF-β familysignature. Black regions indicate the 100% conserved amino acid residues of TGF-β1 in differentspecies, Dark grey regions indicate the high conserved amino acid residues of TGF-β1 in differentspecies, Light grey regions indicate the low conserved amino acid residues of TGF-β1 in differentspecies, “.”indicates the lack of amino acid residues of TGF-β1 in different species.
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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