【摘要】：MicroRNA (miRNA)作為一種典型的內(nèi)源性非編碼RNA,其主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前僅有少數(shù)miRNAs被確定與魚(yú)類(lèi)滲透壓調(diào)控相關(guān)。而超氧化物歧化酶(SOD)作為主要的抗氧化物酶,在生物體中起到了保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子的損傷。至今miRNA和SOD基因在洄游性魚(yú)類(lèi)應(yīng)對(duì)鹽度變化的應(yīng)答作用機(jī)制研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本文以花鰻鱺為研究對(duì)象,研究了花鰻鱺在不同鹽度下的miRNAs表達(dá)譜以及SOD基因在不同鹽度下以及嗜水氣單胞菌刺激下的表達(dá)變化,初步篩選出花鰻鱺參與滲透壓調(diào)節(jié)的miRNAs,探究了花鰻鱺SOD基因在不同應(yīng)激條件下的表達(dá)規(guī)律,為進(jìn)一步研究花鰻鱺滲透壓調(diào)節(jié)的分子機(jī)制以及SOD的抗氧化分子調(diào)控機(jī)理提供了理論依據(jù)。具體研究結(jié)果如下：(1)不同鹽度下花鰻鱺鰓組織miRNA表達(dá)譜的分析通過(guò)Illumina Hiseq2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)三個(gè)不同鹽度(FW,鹽度0;BW,鹽度10以及SW,鹽度25)適應(yīng)條件下的花鰻鱺鰓組織進(jìn)行小RNA測(cè)序。經(jīng)過(guò)去除冗余以及接頭序列,FW組、BW組和SW處理組中分別有11,339,168、11,958,406和12,568,964條純凈序列(clean reads)。通過(guò)和miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行比對(duì)分析,共鑒定出34個(gè)保守miRNAs和預(yù)測(cè)到613個(gè)新的miRNAs。其中,miR-10b-5p, miR-181a, miR-26a-5p, miR-30d和miR-99a-5p在三個(gè)鹽度組中都高豐度表達(dá)。對(duì)比FW組和BW組,共有29個(gè)miRNAs顯著上調(diào)以及72個(gè)miRNAs顯著下調(diào)；通過(guò)對(duì)比FW組和SW組,共有24個(gè)miRNAs顯著上調(diào)以及54個(gè)miRNAs顯著下調(diào)；通過(guò)比對(duì)BW組和SW組,共有24個(gè)miRNAs顯著上調(diào)以及45個(gè)miRNAs顯著下調(diào)。通過(guò)對(duì)12個(gè)在不同鹽度下差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行時(shí)序分析,miR-122和miR-140-3p僅在SW組差異表達(dá),在BW組基本不發(fā)生變化。MiR-10b-5p僅在BW組發(fā)生差異表達(dá),在SW組中表達(dá)量基本保持不變。本研究中對(duì)不同鹽度下差異表達(dá)miRNAs的鑒別表明其潛在的滲透壓調(diào)控作用,為今后miRNAs的滲透壓調(diào)控功能研究提供參考資料。(2)花鰻鱺SOD基因的表達(dá)分析通過(guò)同源比對(duì)以及全長(zhǎng)克隆技術(shù)首次克隆并鑒別出了花鰻鱺兩個(gè)SOD基因,分別命名為AmMnSOD和AmCu/ZnSOD基因。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)SOD基因進(jìn)行一級(jí)到三級(jí)的結(jié)構(gòu)分析,AmMnSOD基因中預(yù)測(cè)到了2個(gè)MnSOD家族特征區(qū)間以及在AmCu/ZnSOD基因中預(yù)測(cè)到了2個(gè)Cu/ZnSOD家族特征區(qū)間。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,結(jié)果顯示這2個(gè)SOD基因在魚(yú)類(lèi)中高度保守。最后,通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)這2個(gè)SOD基因在花鰻鱺不同組織的表達(dá)分布,結(jié)果顯示,這2個(gè)SOD基因均在花鰻鱺的肝臟和肌肉組織中高度表達(dá)。通過(guò)對(duì)不同鹽度(0、10和25鹽度)處理下的花鰻鱺5種組織(鰓、腎、腸、肌肉和肝臟)進(jìn)行SOD基因在mRNA水平和SOD酶活進(jìn)行時(shí)序表達(dá)分析,結(jié)果表明這2個(gè)SOD基因在各個(gè)組織中的]mRNA表達(dá)量和酶活均顯著差異表達(dá),而與其它組織相比,肝臟表現(xiàn)出更強(qiáng)的氧化還原能力。此外,低鹽度環(huán)境能顯著刺激這2個(gè)SOD基因的表達(dá),而高鹽度環(huán)境下會(huì)抑制AmCu/ZnSOD和AmMnSOD基因mRNA表達(dá)以及SOD酶活。對(duì)嗜水氣單胞菌注射和生理鹽水注射處理下的花鰻鱺鰓、肝臟和腎3種組織進(jìn)行分析,這2個(gè)SOD基因的mRNA.酶活以及蛋白在病菌刺激下均發(fā)生了顯著差異表達(dá)(p0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于花鰻鱺的鰓組織,其肝臟和腎臟對(duì)病菌刺激有著更為敏感的免疫應(yīng)答反應(yīng)。由此說(shuō)明,SOD基因參與了花鰻鱺的先天免疫反應(yīng)。
【圖文】：

圖１１花，

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