【摘要】：金烏賊(Sepia esculenta),別稱烏魚、墨魚、烏子等,隸屬軟體動物門(Mollusca)烏賊目(Sepioidea)、烏賊科(Sepiidae)、烏賊屬(Sepia),是我國北方海域中經(jīng)濟價值最大的烏賊和重要的捕撈對象~([1-3])。自20世紀80年代以來,受到海洋環(huán)境的污染和過度捕撈的影響,其資源量明顯衰退,產(chǎn)量急劇下降,目前金烏賊在許多海域已經(jīng)絕跡~([4-6])。為滿足增殖放流和資源恢復(fù)的需求,我國從進入21世紀開始研究金烏賊繁殖技術(shù)并于2007年取得重要突破,金烏賊的增養(yǎng)殖業(yè)得到快速發(fā)展。隨著其繁殖技術(shù)的突破,其增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展,但對于該物種的病害研究尚未見相關(guān)報道。本文以青島市黃島區(qū)某育苗場人工繁育的金烏賊幼體所發(fā)生的大規(guī)模壞死病為例,從病原學(xué)、病理學(xué)、病原菌的傳染途徑分析及藥物篩選進行了相關(guān)的研究。闡述了該疾病發(fā)生的原因,組織病理變化及針對此疾病病原菌的防控藥物篩選。旨在為我國金烏賊病害防控及增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。所得結(jié)果如下:1、金烏賊幼體弧菌性壞死病的病原病理學(xué)研究該疾病的臨床癥狀表現(xiàn)為:金烏賊幼體體色發(fā)黑,不攝食,生長緩慢;體表、肌肉、口腕、觸腕及內(nèi)臟團大面積潰爛,其死亡率高達90%;組織病理學(xué)顯示:患病金烏賊的皮膚色素細胞崩解、肌肉肌絲斷裂、鰓絲結(jié)構(gòu)崩解、肝臟大量細胞壞死脫落、腸道上皮細胞微絨毛脫落和消失。超微病理學(xué)研究結(jié)果顯示,患病金烏賊的肝臟、腸道、鰓絲出現(xiàn)了細胞核腫脹、細胞異常、部分細胞結(jié)構(gòu)溶解消失等不同程度的病變。自患病金烏賊幼體內(nèi)分離出3株優(yōu)勢菌(SE-A、SE-B和SE-C),人工感染實驗證實,SE-A無致病性,SE-B、SE-C為該病的致病菌株。利用細菌形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)方法(16S rDNA)鑒定SE-B為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),SE-C為塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。根據(jù)該病的病癥和病原特點,將該疾病命名為“烏賊弧菌性壞死病”。2、病原菌的來源分析及其相關(guān)毒力基因的檢測通過對患病金烏賊幼體、育苗系統(tǒng)用水和生物餌料—糠蝦進行細菌的來源、分布、優(yōu)勢度和菌株對比以期解析病原傳播途徑。細菌培養(yǎng)結(jié)果顯示糠蝦中攜帶大量細菌且從該樣品中共分離到3株優(yōu)勢菌(KX-A、KX-B和KX-C),自育苗池進水口水樣和育苗池水樣分別分離到1株優(yōu)勢菌(W1-A和W2-A)。根據(jù)相關(guān)優(yōu)勢菌的形態(tài)、生理生化、16S rDNA鑒定結(jié)果可知KX-A為羅尼氏弧菌(Vibrio shilonii),KX-B、W1-A和W2-A為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),KX-C為塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。同時結(jié)合育苗管理技術(shù)工藝并對比育苗系統(tǒng)中各位點、各環(huán)節(jié)中細菌和弧菌數(shù)量以及優(yōu)勢菌株鑒定結(jié)果,證明“烏賊弧菌性壞死病”的2株病原菌的傳播途徑是由糠蝦攜帶進入育苗系統(tǒng)。對2株病原菌—溶藻弧菌和塔氏弧菌的毒力基因檢測結(jié)果表明,溶藻弧菌可能攜帶的11種毒力基因中檢測出與溶血毒素相關(guān)的基因tlh和tdh以及與毒力貢獻相關(guān)的基因ompW、FlaA和Collagenase。塔氏弧菌中檢測出與溶血素毒力基因相關(guān)的vthA,相關(guān)檢測結(jié)果將為解析病原致病機理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。3、抗菌藥物對病原菌的體外抑制作用研究以“烏賊弧菌性壞死病”的2株病原菌為研究對象,開展了抗菌藥物和中草藥的篩選。藥敏試驗結(jié)果顯示,溶藻弧菌對強力霉素和氟苯尼考等藥物敏感,對青霉素、鏈霉素、慶大霉素等藥物具有耐藥性;塔氏弧菌對氟苯尼考和羅美沙星等敏感,對新霉素、鏈霉素、克拉霉素等具有耐藥性。體外抑菌實驗顯示,氟苯尼考的抑菌效果最好,對溶藻弧菌和塔氏弧菌的最小抑菌濃度分別為1.56μg/mL和3.13μg/mL,最小殺菌濃度分別為3.13μg/mL和6.25μg/mL。利用管碟法和二倍稀釋法測定了15味單方中草藥對金烏賊幼體弧菌性壞死病病原菌的體外抑菌實驗顯示,烏梅、五倍子、黃連和大黃4種中草藥對2株病原菌的抑菌效果最好;將4種優(yōu)選中草藥按不同比例組成16種復(fù)方中草藥進行體外抑菌實驗,結(jié)果顯示復(fù)方中草藥的抑菌效果明顯優(yōu)于單方中草藥,平均抑菌圈直徑最大為23.79 mm,最小抑菌濃度降低到1.17 mg/mL。通過體外抑菌實驗篩選出2種中草藥復(fù)方,烏梅:黃連:大黃:五倍子以4:1:4:6比例混合可作為2株病原菌抑菌藥物的首選復(fù)方組合,對2株病原菌的最小抑菌濃度為0.59 mg/mL;烏梅:黃連:大黃:五倍子以3:3:2:2比例混合可作為2株病原菌殺菌藥物的首選復(fù)方組合,對2株病原菌的最小殺菌濃度為0.63 mg/mL。本研究首次報道了金烏賊幼體弧菌性壞死病的病原病理學(xué),病原菌的來源分析及抗生素和中草藥的篩選,為我國金烏賊的疾病防控、增養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論參考。同時,篩選出針對該病病原的專用低毒、高效中草藥配方,為開發(fā)相應(yīng)的中草藥制劑,保障食品綠色安全奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

2圖 1-1 金烏賊外觀圖Fig.1-1Appearance of Sepia esculenta征胴部呈盾形，胴體長大約為胴寬的 2 倍；雄性個體胴體背面的相的粗，且雄性背面條紋斑中夾雜有細小的斑點，雌性個體背清晰，有的靠近身體兩側(cè)，還有的只有密集的細小斑點。其胴楚，，生活狀態(tài)時，體色金黃。胴體周圍的肉鰭狹窄，在其末端不可見白色線條與若干個肉質(zhì)突起[1-2,6]。腕的排列順序與個體差別差異而不同[7]，內(nèi)殼形狀橢圓形，后端有一粗壯的骨針[8]。

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中選取與待分類菌株序列相似或相近的菌株，采用 ClustalX2.1 (http://www.clustal.org/download/current/)軟件進行多序列匹配分析后，用 MEGA 6 (www.megasoftware.net)軟件采用鄰接法構(gòu)建病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。2.4 組織切片的制備與觀察2.4.1 石蠟組織切片的制備與觀察將在 DavidsonísAFA 固定液中浸泡 24h 的組織塊(0.5 0.5cm3)，轉(zhuǎn)移到 70%乙醇溶液中再次浸泡 24 h 后進行組織病理切片制作，制作組織病理切片過程如下：(1) 酒精梯度脫水、二甲苯透明和浸蠟，具體流程如下圖 2-1 所示：
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S947.9

【參考文獻】

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本文編號：2675894