【摘要】：克氏原螯蝦又稱淡水小龍蝦,在分類學(xué)上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目、螯蝦科,是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦品種。在很多地區(qū)已形成大規(guī)模養(yǎng)殖,但在高溫季節(jié)尤其是集約化養(yǎng)殖水體中含有大量細(xì)菌和病毒很容易引發(fā)多種疾病,導(dǎo)致個(gè)體的死亡,對(duì)其經(jīng)濟(jì)收益造成了不利影響。先天免疫是無脊椎動(dòng)物抵御病原微生物入侵的主要免疫方式,研究無脊椎動(dòng)物的先天免疫對(duì)于闡明其免疫機(jī)制具有重要的理論意義,同時(shí)對(duì)提高其抗病能力及抗病育種具有一定的實(shí)踐意義。TNFAIP8(tumor necrosis factorαinduced protein8)是一個(gè)包含有多種蛋白的蛋白質(zhì)家族,與多種自身免疫性疾病、腫瘤等有關(guān),參與了NF-κB、Toll等多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控。本研究旨在探討TNFAIP8在克氏原螯蝦免疫調(diào)節(jié)過程中的功能,取得的主要結(jié)果如下:1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有部分序列,設(shè)計(jì)特異性引物克隆了克氏原螯蝦腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白8(TNFAIP8)基因的開放閱讀框序列(ORF,open reading frame)。該序列長564 bp,編碼187個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的蛋白的理論分子量為21.4 kDa,等電點(diǎn)為9.038。進(jìn)化樹分析表明克氏原螯蝦TNFAIP8基因與無脊椎動(dòng)物TNFAIP8基因的親緣關(guān)系最近。2、通過雙酶切法構(gòu)建了重組質(zhì)粒PGEX-4T-3-Pc-TNFAIP8,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后采用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明克氏原螯蝦TNFAIP8融合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá),獲得的重組蛋白分子量大小為40 kDa左右,濃度約為1 mg/mL。3、利用GST Pull-down技術(shù)從克氏原螯蝦血淋巴蛋白中篩選鑒定了一個(gè)與TNFAIP8相互作用的蛋白—血藍(lán)蛋白(Hemocyanin)。4、提取克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞、腸、鰓、胃、肝胰腺、肌肉、心臟7個(gè)不同組織RNA,通過熒光定量PCR法分析TNFAIP8基因在不同組織中的表達(dá)分布情況,結(jié)果表明其在各個(gè)組織中均表達(dá),其中在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)量最高,其次為鰓和腸。5、LPS和PolyI:C刺激后克氏原螯蝦血淋巴細(xì)胞、鰓、腸中TNFAIP8基因的表達(dá)量顯著降低,而TNFAIP8重組蛋白誘導(dǎo)和TNFAIP8基因的siRNA干擾處理能夠顯著影響Toll、Serpin、Bcl、Lectin、TNF等相關(guān)免疫基因及Hemocyanin在血淋巴細(xì)胞及腮中的表達(dá)。綜上所述,TNFAIP8基因在克氏原螯蝦免疫反應(yīng)中具有一定的功能。
【圖文】：

4.1 總 RNA 的檢測(cè)提取的克氏原螯蝦總 RNA 用1%的瓊脂糖膠160 V恒壓電泳10-15 min，通過電泳檢測(cè)及純度檢測(cè)表明：總 RNA 的 A260/A280 數(shù)值均在2.0左右，如圖4-1可以看到清晰的28S 和18S 兩條帶，沒有明顯拖尾現(xiàn)象，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖4-1 克氏原螯蝦總RNA電泳圖Fig. 4-1 1.0％agrose gel electrophoresis of Procambarus clarkii total RNA4.2 TNFAIP8 基因序列分析生物信息學(xué)分析表明 TNFAIP8 基因的開放閱讀框序列全長為564 bp，編碼的蛋白質(zhì)含有187個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)的成熟蛋白理論分子量為21.4 kDa，其等電點(diǎn)為9.038。將克氏原螯蝦 TNFAIP8 蛋白與脊椎動(dòng)物及無脊椎動(dòng)物進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，克氏原螯蝦 TNFAIP8 蛋白與無脊椎動(dòng)物的TNFAIP8蛋白親緣關(guān)系更近。見圖4-2。A

B圖 4-2 TNFAIP8 基因序列分析（A）和氨基酸序列進(jìn)化樹分析（B）Fig.4-2 Sequence analysis and phylogenetic analysis of PC-TNFAIP8.Fig 4-2 A 起始密碼子 ATG 用方框表示，終止密碼子 TGA 用*表示。B 克氏原螯蝦 TNFAIP8 氨基酸序列進(jìn)化樹分析，用于構(gòu)建進(jìn)化樹的 TNFAIP8 的物種及序列號(hào)為：白蟻（KDR15042.1），溫帶臭蟲（XP_014259819.1），肩突硬蜱（XP_002411876.1），三角河蚌（AHN82531.1），，牡蠣（XP_011417194.1），赤擬谷盜（XP_015838848.1），美洲鱟（XP_013776311.1）亞洲龍魚（KPP59962.1），原雞（XP-015136101.1），家鼠（NP_001171230.1）人（NP_689575.2），密西西比鱷（KYO42541.1），斑馬魚（NP_956626.1）。Fig 4-2 A.Initiation codon ATG is boxed，and termination codon TAG marked with *. B.Phylogenetic analysis wasperformed by MEGA program based on the TNFAIP8 amino acid sequences from various animals. The phylogenetic treewas constructed using the neighbor-joining algorithm method and bootstrap values (1000 repetitions) of the branches areindicated. The origins and accession numbers of the TNFAIP8 sequences are: Zootermopsis nevadensis, KDR15042.1;Cimex lectularius,XP_014259819.1;Ixodes scapularis, XP_002411876.1;Hyriopsis cumingii, AHN82531.1 ; Crassostrea gigas, XP_011417194.1; Tribolium castaneum, XP_015838848.1;Gallus galluss, XP-0151 36101.1;Mus musculus,NP_001171230.1;Homo sapiens, NP_689575.2;Alligator mississippiensis, KYO42541.1; Scleropages formosus, KPP59
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 楊明;趙琦;張艷橋;;TNFAIP8蛋白的過表達(dá)預(yù)測(cè)腸型胃癌不良預(yù)后的研究[A];第9屆全國胃癌學(xué)術(shù)會(huì)議暨第二屆陽光長城腫瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 于穎穎;克氏原螯蝦TNFAIP8基因的表達(dá)特征及功能分析[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2671751