【摘要】：本研究以菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)為研究對(duì)象,旨綜合飼料學(xué)、酶學(xué)和分子生物學(xué)的研究方法,研究了廣西菲牛蛭和廣東菲牛蛭的遺傳背景,并研究了血液、配合飼料和賴氨酸添加對(duì)菲牛蛭生長(zhǎng)、抗氧化指標(biāo)、非特異性免疫指標(biāo)、水蛭素活性及水蛭素基因(HM)表達(dá)的影響。主要研究結(jié)果如下:1、基于COⅠ和18S rDNA部分序列分析粵、桂2個(gè)菲牛蛭種群的遺傳多樣性采用PCR擴(kuò)增技術(shù)測(cè)定了廣東廣西共35尾菲牛蛭COⅠ和18S rDNA部分序列,并對(duì)COⅠ和18S rDNA部分序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果顯示:COⅠ基因共檢出9個(gè)變異位點(diǎn),定義單倍型9個(gè);廣西菲牛蛭單倍型多樣性(0.737)和核苷酸多樣性(0.00166)高于廣東菲牛蛭(0.638,0.00119)。18S rDNA基因共檢出1個(gè)變異位點(diǎn),定義單倍型3個(gè);廣東菲牛蛭單倍型多樣性(0.154)和核苷酸多樣性(0.00014)高于廣東菲牛蛭(0.1100,0.0001)。COⅠ基因單倍型之間的遺傳距離在0.0015~0.0077之間,18S rDNA單倍型之間的遺傳距離在0.0009~0.0018之間。COⅠ和18S rDNA優(yōu)勢(shì)單倍型廣西所占比例分別為60%和58.6%。結(jié)果表明:廣西菲牛蛭遺傳多樣性水平高于廣東菲牛蛭。2、配合飼料和血液對(duì)菲牛蛭水蛭素活性、抗氧化指標(biāo)及非特異性免疫指標(biāo)的影響研究采用生化方法測(cè)定了配合飼料組和血液組菲牛蛭水蛭素活性、抗氧化指標(biāo)(SOD、CAT、MDA)和非特異性免疫(AKP、ACP、LSZ)。結(jié)果顯示:配合飼料組水蛭素活性略低于血液組,差異性不顯著(P0.05);配合飼料組腸道超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性顯著高于血液組腸道SOD和CAT活性(P0.05),配合飼料組腸道丙二醛(MDA)含量稍低于血液組,配合飼料組嗉囊SOD活性顯著低于血液組(P0.05),CAT活性稍低于血液組,而配合飼料組的嗉囊MDA含量顯著低于血液組(P0.05)。腸道組織中,配合飼料組溶菌酶(LSZ)活性顯著低于血液組(P0.05),而堿性磷酸酶(AKP)和堿性磷酸酶(ACP)活性顯著高于血液組(P0.05);嗉囊組織中,配合飼料組LSZ活性稍低于血液組,而AKP和ACPA稍高于血液組,差異不顯著(P0.05)。研究表明:菲牛蛭能攝食配合飼料,水蛭素活性未受影響;對(duì)腸道抗氧化能力有一定的增強(qiáng)作用,在MDA、AKP和ACP含量能達(dá)到或超過血液飼養(yǎng)水平。3、幾種氨基酸的篩選及水蛭素活性的測(cè)定以賴氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、�；撬�、谷氨酸和組氨酸為目標(biāo)氨基酸,分別配制成1g/kg、2g/kg和3g/kg的濃度梯度對(duì)菲牛蛭養(yǎng)殖試驗(yàn)。結(jié)果顯示:賴氨酸添加攝食效果最好,其他添加組經(jīng)過第一次攝食后不攝食或少量攝食。水蛭素活性賴氨酸添加組從低濃度組到高濃度組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),且在添加濃度為2g/kg時(shí),水蛭素活性最高(165.6U/g),且稍高于血液對(duì)照組(162.5U/g),其他添加組水蛭素活性無規(guī)律。綜合分析菲牛蛭的攝食情況及水蛭素活性,篩選出賴氨酸進(jìn)行后續(xù)的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。4、配合飼料中賴氨酸添加對(duì)菲牛蛭生長(zhǎng)及相關(guān)因子的影響以賴氨酸為目標(biāo)氨基酸,分別配制成0g/kg、0.7g/kg、1.4g/kg、2.1g/kg的濃度梯度,以血液為對(duì)照組,對(duì)菲牛蛭進(jìn)行為期37d的飼養(yǎng)。采用生物統(tǒng)計(jì)、生化、RT-PCR與熒光定量PCR技術(shù)等方法研究了賴氨酸添加對(duì)菲牛蛭生長(zhǎng)、抗氧化指標(biāo)、非特異性免疫指標(biāo)、水蛭素活性及水蛭素基因(HM)表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:(1)配合飼料中添加賴氨酸后的特定生長(zhǎng)率(0.77~0.82)顯著高于不添加組(0.60)(P0.05),添加組增重率(29.76%~32.12%)顯著高于不添加組(22.67%)(P0.05),特定生長(zhǎng)率和增重率均顯著低于血液組;添加賴氨酸濃度為1.4g/kg時(shí),特定生長(zhǎng)率(0.82)和增重率(32.12%)最高。(2)在腸道和肌肉組織中,未添加組SOD活性顯著高于血液組(P0.05);添加組中隨著賴氨酸濃度的升高,SOD呈“上升-下降”趨勢(shì),添加濃度為1.4g/kg時(shí),SOD酶活性最高,且顯著高于血液組(P0.05);在腸道組織中,當(dāng)賴氨酸添加為1.4g/kg時(shí),CAT含量最高,在肌肉和嗉囊組織中,在濃度為1.4g/kg時(shí),CAT活性與血液組無顯著差異(P0.05)。MDA含量添加組、未添加組和血液組之間不存在顯著差異(P0.05),肌肉組織和嗉囊組織呈現(xiàn)出“高低交錯(cuò)”現(xiàn)象,菲牛蛭MDA含量基本處于平衡狀態(tài)。添加組LSZ、ACP、AKP活性高于血液組,在賴氨酸添加為1.4g/kg時(shí),總AKP酶活性最高和肌肉組織中的AKP酶活性最高,且顯著高于血液對(duì)照組(P0.05)。(3)未添加組水蛭素活性和水蛭素基因(HM)相對(duì)表達(dá)量顯著低于添加組(P0.05),在賴氨酸添加實(shí)驗(yàn)中,隨著賴氨酸濃度的升高,水蛭素活性和水蛭素基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì),先升高后降低;添加濃度為1.4g/kg時(shí),水蛭素活性(285.52±5.68U/g)和水蛭素基因(HM)表達(dá)量最高(0.76±0.03);且和血液組差異不顯著。研究表明:適宜濃度的賴氨酸添加可以有效的提高菲牛蛭的生長(zhǎng)、抗氧化能力和免疫功能,并能促進(jìn)水蛭素活性升高和水蛭素基因的表達(dá)。綜合分析,得到菲牛蛭賴氨酸適宜的添加濃度為1.4g/kg。
【圖文】：

與馬尼拉菲牛蛭水蛭素基因 Hm1、Hm2 的同源性分別為 90%、88.6%。黎淵弘等（2011）從廣西菲牛蛭中得到水蛭素基因 cDNA 序列長(zhǎng)度為 251 bp，編碼框由 83 個(gè)氨基酸組成，包括 20 個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，63 個(gè)氨基酸組成的成熟肽。廣西菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列和廣東菲牛蛭、馬尼拉菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列相比較，同源性分別為 94%、91.8%、84.7%。

與馬尼拉菲牛蛭水蛭素基因 Hm1、Hm2 的同源性分別為 90%、88.6%。黎淵弘等（2011）從廣西菲牛蛭中得到水蛭素基因 cDNA 序列長(zhǎng)度為 251 bp，編碼框由 83 個(gè)氨基酸組成，，包括 20 個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，63 個(gè)氨基酸組成的成熟肽。廣西菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列和廣東菲牛蛭、馬尼拉菲牛蛭水蛭素基因的氨基酸序列相比較，同源性分別為 94%、91.8%、84.7%。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2671562