【摘要】：刺激隱核蟲是一種海洋寄生性纖毛蟲,其生活史具有多態(tài)性,必須經(jīng)歷寄生于海水硬骨魚體表的滋養(yǎng)體階段,是引起"海水白點(diǎn)病"的病原生物。近年來隨著養(yǎng)殖密度的增大,對海水養(yǎng)殖業(yè)造成的影響日益嚴(yán)重,引起了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前的物理、化學(xué)防治方法均無法起到有效作用,因而亟待研究出可行的防治方法。本實(shí)驗(yàn)從Cryptocaryon irritans滋養(yǎng)體cDNA文庫中篩選出一個類木瓜蛋白酶(papain-like protease,CiPCP)的 cDNA,通過 5'RACE(Rapid Amplification of 5'-end of cDNA)方法獲得完整開放閱讀框,對其進(jìn)行分子特征分析,并初步評價(jià)了該蛋白對大黃魚的免疫預(yù)防作用。CiPCP開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)由984 bp堿基組成,編碼327個氨基酸,分子量理論值為37.6 kDa。實(shí)驗(yàn)中以人工合成的方式完成其中14個非通用密碼子的修改,獲得適合在原核系統(tǒng)表達(dá)的CiPCP ORF序列,并亞克隆出5'端下游301 bp之后編碼成熟酶結(jié)構(gòu)域的684 bp堿基序列(CiPCt),重組于pET 28a載體后轉(zhuǎn)化到E.coli BL-21(DE3)菌株,通過自誘導(dǎo)方式獲得融合蛋白rCiPCPt。以rCiPCPt免疫小鼠獲得抗血清,用于Western Blotting分析,結(jié)果表明該蛋白具有良好的免疫原性,可特異性識別C.irritans各時(shí)期的天然蛋白。同時(shí),該結(jié)果也說明C.irritan 天然CiPCP經(jīng)水解去除前肽,形成26 kDa左右的成熟酶。利用間接免疫熒光抗體試驗(yàn)對C.irritans幼蟲時(shí)期的CiPCP進(jìn)行定位,結(jié)果顯示該蛋白酶主要分布于胞口,屬于分泌型蛋白酶,與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果相符。大黃魚經(jīng)抗原rCiPCPt免疫后,獲得了對C.irritans致死劑量(45,000 theront/fish)的感染性幼蟲攻擊54%的免疫保護(hù)率,實(shí)時(shí)定量PCR顯示大黃魚脾臟中的interleukin-1β的表達(dá)上調(diào)。綜合分析,初步證明該蛋白對大黃魚的C.irritans感染具有一定的免疫保護(hù)作用,為"海水白點(diǎn)病"的防治研究提供了線索。
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S941.5

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本文編號：2668068