發(fā)布時(shí)間：2020-05-16 02:30

【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為18~25nt(核苷酸)的非編碼RNA,在各個(gè)物種之間具有高度保守性,且在生物體各組織中廣泛存在,可在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平調(diào)控大量的靶基因。miRNA的表達(dá)具有時(shí)間特異性和組織特異性,在生長(zhǎng)、發(fā)育、凋亡、自噬、脂肪代謝等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前的研究表明,miRNA對(duì)魚類脂肪代謝的調(diào)控方式主要是通過翻譯調(diào)控,即通過“種子區(qū)”與被調(diào)控的脂代謝相關(guān)靶基因的3’UTR通過不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式相結(jié)合,抑制靶基因翻譯。銅(Cu)是魚類必需的一種微量元素,參與魚體多種生命活動(dòng),但過量富集時(shí)會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生不利影響。目前的研究表明,銅對(duì)黃顙魚脂肪代謝產(chǎn)生影響,但是其機(jī)制尚未完全清楚。銅暴露是否影響黃顙魚體內(nèi)miRNA的表達(dá)?miRNA是否介導(dǎo)了銅對(duì)黃顙魚脂肪代謝的影響?本課題以黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)為研究對(duì)象,首先對(duì)其進(jìn)行不同水體銅濃度的暴露實(shí)驗(yàn),測(cè)得兩個(gè)miRNA組,并對(duì)兩個(gè)miRNA組進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選出銅暴露下差異表達(dá)的miRNA,對(duì)這些miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析和驗(yàn)證,探討了miRNA介導(dǎo)銅影響黃顙魚肝臟脂代謝的機(jī)制。主要研究成果如下:1銅暴露下黃顙魚肝臟差異表達(dá)miRNA的篩選為了研究銅暴露下黃顙魚肝臟的差異表達(dá)miRNA,以兩種水體Cu~(2+)濃度(對(duì)照組:1±1μg Cu~(2+)/L;處理組:62±5μg Cu~(2+)/L)養(yǎng)殖黃顙魚幼魚60 d,應(yīng)用高通量測(cè)序測(cè)得銅暴露過后2個(gè)黃顙魚肝臟miRNA組,得到172個(gè)已知miRNA(mature miRNA),5個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA(novel miRNA)。相比于對(duì)照組,銅處理組中顯著差異表達(dá)(P0.05,|fold-chenge|≥2)miRNA共18個(gè),其中2個(gè)(miR-212和chr20-5274)上調(diào),16個(gè)(miR-203a、205、1788-3p、375、31、196a、203b-3p、2187-5p、196d、459-3p、153a、miR-725和2個(gè)novel-miRNA:chr4-1432、chr-7684)下調(diào)。通過TargetScanFish6.2預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的靶基因并與同時(shí)測(cè)得的黃顙魚肝臟轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析,得到457個(gè)潛在的靶基因,對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析,結(jié)果顯示,這些靶基因顯著富集在醚脂代謝、甘油磷脂代謝、亞油酸代謝和α-亞麻酸代謝途徑中(P0.05),且大量靶基因與生物學(xué)過程相關(guān);在富集分析時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-205的靶基因與脂代謝相關(guān)通路有顯著的關(guān)聯(lián)(P0.05)。根據(jù)上述結(jié)果,我們預(yù)測(cè)miR-205介導(dǎo)了銅誘導(dǎo)的脂代謝變化,所以在后續(xù)研究中主要集中于miR-205。2 miR-205脂代謝相關(guān)靶基因驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-205是通過調(diào)控哪些靶基因的特定位點(diǎn)與脂肪代謝產(chǎn)生直接或間接的關(guān)聯(lián),我們首先通過TargetScanFish6.2預(yù)測(cè)并結(jié)合黃顙魚肝臟轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合篩選靶基因,篩選出脂肪酸合成酶fas、lxrα、ddit3、lamp2、caspcase3a和baxa包含有與miR-205潛在結(jié)合位點(diǎn)的3’UTR序列,然后通過克隆得到包含結(jié)合位點(diǎn)的上下游各200bp左右的序列,并將各個(gè)基因的片段分別重組到psiCHECK-2質(zhì)粒中海腎熒光素酶(Ranilla Luciferase,Rluc)基因的3’UTR中not1與xhol酶切位點(diǎn)之間,構(gòu)建野生型重組質(zhì)粒,同時(shí)將靶基因的特定結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)镚TCAGA,構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒。最后通過miRNA mimics、miRNA NC與重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK-293T細(xì)胞的方式進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證出miR-205可以顯著抑制WT-fas、WT-lxrα、WT-ddit3、WT-lamp2、WT-casp3a和WT-baxa的海腎熒光素酶酶活性(P0.05),但是對(duì)Mut-fas、Mut-lxrα、Mut-ddit3、Mut-lamp2、Mut-casp3a和Mut-baxa的海腎熒光素酶酶活性沒有影響(P0.05),miR-205 NC對(duì)WTMUT-fas、lxrα、ddit3、lamp2、casp3a和baxa的熒光素酶活性均沒有影響(P0.05)。結(jié)果表明,miR-205可以直接結(jié)合fas 3’UTR(1031-1052 bp)、lxrα(40-61 bp)、ddit3(171-192 bp)、lamp2(621-642 bp)、casp3a(542-563 bp)和baxa(406-427bp),并發(fā)揮抑制作用。fas、lxrα、ddit3、lamp2、casp3a和baxa是miR-205的直接靶基因。3 miR-205介導(dǎo)銅對(duì)黃顙魚肝臟脂代謝的影響研究實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、10μM Cu孵育、10μM LXR拮抗劑孵育和10μM Cu+10μM LXR拮抗劑共孵育組,孵育時(shí)間為24h和48h。以10μM的銅濃度暴露黃顙魚原代肝臟細(xì)胞,結(jié)果顯示,相比于對(duì)照組,銅處理組在24h和48h都顯著抑制了miR-205的表達(dá)(P0.05),在miR-205被抑制后,其靶基因fas和ddit3的mRNA表達(dá)量發(fā)生顯著上調(diào)(P0.05),LXRα的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P0.05),脂肪酸合成酶(FAS)活性與甘油三酯(TG)含量顯著上升(P0.05);細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和體積都顯著增大(P0.05);在單獨(dú)LXR拮抗劑作用下,FAS的活性、TG含量細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小顯著下降(P0.05);但在銅和LXR拮抗劑同時(shí)作用下FAS的活性、TG含量沒有顯著變化(P0.05),細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量和大小沒有顯著性變化(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,銅暴露抑制黃顙魚肝臟細(xì)胞中miR-205的轉(zhuǎn)錄,使其對(duì)靶基因lxra的翻譯抑制作用顯著下降,導(dǎo)致LXRα蛋白量增加,進(jìn)而激活了脂肪合成相關(guān)通路,使FAS活性、TG含量、細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)量和體積上升,造成肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究表明miR-205通過靶向lxra介導(dǎo)了銅誘導(dǎo)的黃顙魚肝臟脂質(zhì)沉積。水體銅暴露抑制了黃顙魚肝臟內(nèi)miR-205的表達(dá),使miR-205對(duì)下游靶基因lxrα、fas的翻譯抑制作用減弱,使細(xì)胞內(nèi)FAS活性上升,TG含量增加直接造成細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積;通過削弱對(duì)下游的ddit3、casp3a、baxa和lamp2的抑制作用,進(jìn)而從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、自噬等途徑,間接影響了黃顙魚肝臟的脂肪代謝。
【圖文】：

圖 1-1 miRNA 的生物合成（Faller et al 2008）Fig.1-1 miRNA biogenesis (Faller et al 2008)miRNA 的作用方式miRNA-靶基因的作用方式主要是通過識(shí)別miRNA與靶基因部其結(jié)合位點(diǎn)通常位于靶基因 mRNA 的 3’UTR 中，介導(dǎo)基因的004)。miRNA 的 5’端的“種子區(qū)”既第 2-7 個(gè)核苷酸與靶基因結(jié)發(fā)靶基因沉默(Grimson et al 2007)。有研究認(rèn)為，miRNA：mR形成位置可能影響 miRNA 對(duì)靶基因的沉默效率 (Sandberg et a miRNA 結(jié)合位點(diǎn)，互補(bǔ)性僅限于種子序列或種子序列加 miRN而，在特殊情況下，特別是當(dāng) mRNA 具有弱種子匹配時(shí)，miR因的互補(bǔ)性可能會(huì)有助于 miRNA 靶標(biāo)選擇(Huntzinger et al 201 miRNA5’末端核苷酸若是埋藏在 AGO 蛋白包被的中間區(qū)域，

圖 1-2 miRNAs 通過 Watson-Crick 堿基配對(duì)識(shí)別其靶標(biāo) (Huntzinger et al 2011)Fig. 1-2 miRNAs recognize their targets by Watson Crick base pairing (Huntzinger et al 2011)1.4 miRNA 與脂肪代謝miRNA 在脂肪細(xì)胞的分化、脂肪合成和氧化的過程中發(fā)揮重要作用（Esau et al2006, Rottiers et al 2012, Cui et al 2017）。對(duì)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝發(fā)揮作用的 miRNA 包括miR-122、miR-370、miR-378、miR-335、miR-125a-5p 和 miR-33 等。miR-122 可以直接調(diào)控參與脂肪酸合成和氧化的幾個(gè)基因（fas、acc1 和 acc2） (Elmén J et al 2008,Esau et al 2006)。高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體內(nèi) miR-122 的表達(dá)量下降，介導(dǎo)了膽固醇合成的減少和脂肪酸氧化，從而減少了肝臟脂肪變性 (Esau et al 2006)。miR-370 對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用與 miR-122 類似，miR-370 可以靶向肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（Carnitine palmitoyltransferase 1a ，Cpt1a），阻礙長(zhǎng)鏈脂肪酸在線粒體的入膜轉(zhuǎn)運(yùn)，，從而減少脂肪酸的氧化(Iliopoulos et al 2010)。miR-370 轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞系 HepG2，導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2666016