【摘要】：對(duì)蝦在人工控制條件下卵巢難以發(fā)育成熟,一直是對(duì)蝦育苗生產(chǎn)中的難題。雖然采用眼柄切除的方法可以促進(jìn)親蝦發(fā)育、成熟,但是這種方法直接損害親蝦健康,影響卵子質(zhì)量。因此探索對(duì)蝦卵黃發(fā)生調(diào)控機(jī)理,弄清影響卵巢發(fā)育的內(nèi)外因子是當(dāng)前對(duì)蝦繁殖與發(fā)育生物學(xué)的研究熱點(diǎn)和重要課題。本研究以凡納濱對(duì)蝦為研究對(duì)象,在通過抑制消減雜交技術(shù)篩選出眼柄切除前后差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上,選擇核自身抗原精子蛋白基因和極孔樣蛋白基因進(jìn)行深入研究,為凡納濱對(duì)蝦卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)成功克隆出了核自身抗原精子蛋白基因(nuclear autoantigenic sperm protein,NASP)和極孔樣蛋白基因(polehole-like protein,PHL)的cDNA全長(zhǎng)序列,并且利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)這兩個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期在卵巢和肝胰腺組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1)通過RACE技術(shù)克隆出的核自身抗原精子蛋白基因全長(zhǎng)2058bp,其中包括92 bp 5’端非編碼區(qū),147 bp 3’端非編碼區(qū)及2019 bp開放閱讀,編碼673個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為74.18 KD,理論等電點(diǎn)為4.46。該序列已提交至GenBank,序列號(hào)為KT274811。在NCBI上進(jìn)行BLASTN序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)其與斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)核自身抗原精子蛋白基因序列(FJ040859.1)相似性最高,為90%。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),此蛋白序列含有SHNi-TPR和TPR_2兩種結(jié)構(gòu)域,且具有4個(gè)糖基化位點(diǎn)。此外,通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹比較了凡納濱對(duì)蝦NASP與其它物種間的遺傳距離,結(jié)果顯示與班節(jié)對(duì)蝦的序列最接近。采用熒光定量PCR方法測(cè)定了其在卵巢與肝胰腺中不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果表明,NASP在卵巢中的表達(dá)量顯著高于肝胰腺,且在卵巢發(fā)育第二期表達(dá)量最高,第三期表達(dá)量最低,各期之間無顯著性差異。NASP的主要功能與細(xì)胞分裂、增殖相關(guān)。2)通過RACE技術(shù)克隆出6343bp極孔樣蛋白基因,包括117bp 5’端非編碼區(qū),61 bp3’端非編碼區(qū)及6165 bp開放閱讀,編碼2054個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)分子量為224.46KD,理論等電點(diǎn)為4.84。該序列已提交至GenBank,序列號(hào)為KU981017。通過BASTP比對(duì)發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與斑節(jié)對(duì)蝦極孔樣蛋白(ACV60547.1)相似性最高為75%。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),極孔樣蛋白序列含有PbH1、EPTP兩種結(jié)構(gòu)域,且具有12個(gè)糖基化位點(diǎn),23個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。采用熒光定量PCR方法測(cè)定了其在卵巢和肝胰腺中不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果表明,極孔樣蛋白基因在卵巢中的表達(dá)量明顯高于肝胰腺。在卵巢中,第一期的表達(dá)量顯著高于其它時(shí)期,且隨著卵巢的發(fā)育表達(dá)量逐漸降低直到第六期稍有回升。在肝胰腺中除了第六期的表達(dá)量較低,其它時(shí)期相互之間無顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究凡納濱對(duì)蝦卵黃發(fā)生、卵巢發(fā)育機(jī)理提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

1-1 凡納濱對(duì)蝦卵巢與肝胰腺中總 RNA 電泳(1,2,3 取自卵巢，4,5,6 取自肝胰腺) Total RNA from ovaries and hepatopancreas of L. (1,2,3 from ovaries,4,5,6 from hepatopancreas)序列 全長(zhǎng) 2258bp，其中開放閱讀框（opening r73 個(gè)氨基酸。在起始密碼子上有 92bp 5’UTR，其中包括 poly（A）及加尾信號(hào) AA登錄號(hào)為：KT274811。

圖 1-4（a）18s 熔解曲線Fig.1-4（a） Melt curve of 18s圖 1-4（b）核自身抗精原蛋白基因熔解曲線Fig.1-4（b） Melt curve of NASP線
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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