發(fā)布時(shí)間：2020-05-12 04:19

【摘要】：大彈涂魚(yú)(Boleophthalmus pectinirostris)屬于蝦虎魚(yú)類(lèi),是暖水、廣溫、廣鹽性魚(yú)類(lèi),生活于河口港灣潮間帶淤泥灘涂及紅樹(shù)林區(qū)。其生境的特異性,潮間帶鹽度變化的劇烈性,對(duì)氨氮脅迫的耐受性及其可在空氣中呼吸等獨(dú)特的兩棲適應(yīng)性,吸引科學(xué)家對(duì)其生理生化和適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究。本研究以大彈涂魚(yú)為研究對(duì)象,對(duì)其Rhgp和Aquaporin基因家族進(jìn)行克隆、功能分析、基因表達(dá)和分子進(jìn)化研究,厘清這兩類(lèi)滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因在魚(yú)類(lèi)及陸生動(dòng)物間的相關(guān)性,闡述其進(jìn)化選擇,以期達(dá)到大彈涂魚(yú)排鹽基因進(jìn)化分析的研究目的,從而有效解決海水、淡水、洄游性、廣鹽性等環(huán)境對(duì)排鹽基因的選擇壓力分析。大彈涂魚(yú)是一種兩棲硬骨魚(yú),主要生活在潮間帶,生境鹽度變化劇烈,大彈涂魚(yú)表現(xiàn)出對(duì)鹽度和氨(銨)脅迫的耐受性。Rhgp基因家族在魚(yú)鰓的NH_4~+轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用,但他們對(duì)鹽度響應(yīng)的反應(yīng)在這個(gè)物種中仍然不清楚。在本文研究中,從大彈涂魚(yú)的鰓中克隆了四種Rhgp基因家族的基因Rhag,Rhbg,Rhcg1和Rhcg2。編碼序列長(zhǎng)度分別為1,308 bp,1,386 bp,1,458 bp和1,455 bp,編碼435,461,485和484個(gè)氨基酸,Rhag,Rhcg1,Rhcg2和Rhbg分別含有11和12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。低鹽脅迫下Rhag的相對(duì)表達(dá)量顯著降低,而高鹽脅迫下Rhbg的相對(duì)表達(dá)量顯著增加。在高鹽脅迫或低鹽脅迫下,Rhcg1的相對(duì)表達(dá)量降低但不顯著,高鹽脅迫下Rhcg2的表達(dá)量顯著增加,然后下降。而在低鹽脅迫下,Rhcg2的表達(dá)顯著下降。這意味著這些Rhgp基因家族不僅是NH_4~+的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,而且還參與了大彈涂魚(yú)的鹽度脅迫的耐受性。分子進(jìn)化分析檢測(cè)到魚(yú)類(lèi)中存在正選擇位點(diǎn),表明在魚(yú)類(lèi)向不同鹽度環(huán)境的適應(yīng)輻射中這四種基因可能發(fā)生著適應(yīng)性進(jìn)化。本研究對(duì)大彈涂魚(yú)中水通道蛋白基因家族進(jìn)行了全面概述,并為該基因家族的進(jìn)化和鹽度脅迫調(diào)控提供了新的見(jiàn)解。水通道蛋白基因家族已經(jīng)在一些魚(yú)類(lèi)中被系統(tǒng)地表征,但在大彈涂魚(yú)中還沒(méi)有被識(shí)別及克隆。在本文研究中,16個(gè)水通道蛋白基因(BpAQP)在大彈涂魚(yú)基因組中被鑒定出來(lái)。大彈涂魚(yú)水通道蛋白基因家族的六個(gè)成員(BpAQP0,BpAQP1,BpAQP3,BpAQP4,BpAQP8和BpAQP9)在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了硬骨魚(yú)特異性全基因組復(fù)制,現(xiàn)在每個(gè)基因在不同染色體上有兩個(gè)多拷貝�；虮磉_(dá)譜分析表明,在9種不同組織(鰓,腸,皮膚,肝臟,腦,脾,腎,性腺(雌性)和肌肉)中檢測(cè)到BpAQP基因的轉(zhuǎn)錄,并且發(fā)現(xiàn)每種BpAQP的基因表達(dá)模式不相同。此外,為了探索大彈涂魚(yú)鰓中四種AQP基因(BpAQP1a,BpAQP1b,BpAQP3a和BpAQP3b)的時(shí)空分布規(guī)律,我們進(jìn)行了大彈涂魚(yú)鹽度脅迫實(shí)驗(yàn),將其從10‰海水(典型灘涂鹽度)轉(zhuǎn)移到高滲海水(30‰)或低滲淡水(0‰)中,然后觀察四個(gè)基因的時(shí)空分布規(guī)律。通過(guò)相關(guān)功能基因家族鑒定、克隆和進(jìn)化分析,不僅完善并補(bǔ)充了大彈涂魚(yú)基因組學(xué)數(shù)據(jù),而且在大彈涂魚(yú)生理學(xué),尤其是為分子進(jìn)化生物學(xué)和分子遺傳學(xué)等方面的實(shí)驗(yàn)開(kāi)辟了道路,為后續(xù)對(duì)大彈涂魚(yú)適應(yīng)環(huán)境過(guò)程重要排鹽基因篩選提供參考。并此,將豐富和加深對(duì)大彈涂魚(yú)排鹽基因在水生和陸生環(huán)境中功能和作用機(jī)理的理解,并將擴(kuò)展對(duì)整個(gè)蝦虎魚(yú)類(lèi)的排鹽基因克隆及分子進(jìn)化研究,其成果也預(yù)計(jì)在水生動(dòng)物環(huán)境脅迫及基因選擇進(jìn)化研究等領(lǐng)域產(chǎn)生重大的影響。
【圖文】：

圖 2.1 大彈涂魚(yú)中所有已鑒定的 Rhgp 基因的滑動(dòng)窗口圖。Ka/Ks 值和每個(gè) Rhgp 編碼序列（bp）的位置分別顯示在 y 軸和 x 軸上，窗口大小為 36 bp，步長(zhǎng)為 6 bp。Fig 2.1 Sliding window plots of all the identified Rhgp genes in B. pectinirostris. The Ka/Ks value andthe position of each Rhgp coding sequence (bp) are shown on the y-axis and x-axis, respectively. Thewindow size is 36 bp, and the step size is 6 bp.2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析由在 SPSS 軟件下進(jìn)行，使用單因素方差分析（ANOVA）測(cè)試平均值之間的差異，然后通過(guò) Tukey 或 Dunnett T3 事后檢驗(yàn)對(duì)平均值進(jìn)行多重比較，這取決于Levene’s 對(duì)方差同質(zhì)性的檢驗(yàn)結(jié)果。P<0.05 的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（S.D.）。2.3 結(jié)果2.3.1 Rhgp 基因的核苷酸、氨基酸序列及系統(tǒng)發(fā)育分析我們從大彈涂魚(yú)的鰓中克隆了 Rhag，Rhbg，Rhcg1 和 Rhcg2 基因。他們的編碼序列長(zhǎng)度為 1,308 bp，1,386 bp，1,458 bp 和 1,455 bp，分別編碼 435，461，485 和 484

第二章 大彈涂魚(yú) Rhgp 基因家族克隆及分子進(jìn)化（G194，H200，F(xiàn)250 和 N251）和（G191，H197，F(xiàn)247 和 N248），NH4+對(duì) NH3傳導(dǎo)的去質(zhì)子化（D176，S180，H184 和 H343），（D178，S182，H186 和 H345），（D192，S196，，H200 和 H359）和（D189，S193，H197 和 H356）的位點(diǎn)，但它缺乏像大腸桿菌 AmtB 中那樣的潛在的 π 陽(yáng)離子結(jié)合位點(diǎn)。此外，我們還預(yù)測(cè)出了兩個(gè)或三個(gè) N-糖基化位點(diǎn)。毫無(wú)疑問(wèn)，這些序列比對(duì)預(yù)測(cè)顯示了四個(gè)基因的序列高度保守性。
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

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