【摘要】：魚類干擾素(Interferon,IFN)是一種高效能、低分子量的可分泌蛋白,可誘導(dǎo)未受病毒感染的細(xì)胞進入抗病毒狀態(tài)。大量研究證明,魚類I型干擾素在保護魚體免受病毒感染中發(fā)揮重要作用。但I型干擾素兩個亞組在抗病毒作用方面存在時空差異,第一亞組可以快速誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)但效果較弱,第二亞組誘導(dǎo)抗病毒反應(yīng)延遲但高效。斑馬魚I型干擾素的第一亞組中存在兩種基因:IFNφ1和IFNφ4。目前關(guān)于IFNφ1基因的研究較多,包括IFNφ1的表達以及其蛋白的功能等。相對IFNφ1,IFNφ4的研究較少,尤其是其功能方面的研究。目前,不少學(xué)者對IFNφ4是否可以保護魚類免受病毒感染的相關(guān)研究結(jié)果還存在分歧。腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)作為重要的炎癥因子,在抵抗細(xì)菌和病毒感染以及清除被感染的細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要的作用。本研究對斑馬魚進行腹腔注射免疫刺激物、細(xì)菌和病毒病原,并采用熒光定量PCR技術(shù)分析IFNφ1和IFNφ4以及TNFα和TNFRSF1a在腎臟和脾臟中的表達。旨在分析當(dāng)受到不同的病原刺激物感染時IFNφ1、IFNφ4、TNFα和TNFRSF1a在免疫器官(腎臟和脾臟)中的動態(tài)表達。同時以IFNφ1為對照,對IFNφ4生物學(xué)功能進行更深入研究。對斑馬魚進行腹腔注射免疫刺激物、細(xì)菌和病毒病原,并采用熒光定量PCR分析IFNφ1和IFNφ4在腎臟和脾臟中的表達水平。組織表達結(jié)果顯示:IFNφ1和IFNφ4在斑馬魚腎臟、脾臟和心臟中表達量相對較高,在肝中表達量極低。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic acid-polycytidylic acid,PolyI:C)能夠調(diào)控腎臟和脾臟中IFNφ1和IFNφ4基因的表達。不同細(xì)菌和病毒病原分別感染斑馬魚,結(jié)果1)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,A.hydrophila)感染后IFNφ1轉(zhuǎn)錄本在脾臟(6 h和24 h)和腎臟(24 h)中顯著升高;IFNφ4在脾臟和腎臟(6 h和48 h)表達水平也有顯著上調(diào);2)鯉春病毒血癥病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)感染時,IFNφ1表達量有顯著升高;在整個感染過程中,IFNφ4表達僅在脾臟(7 d)和腎臟(3 d)有微量上調(diào);3)E.tarda感染后,在腎臟和脾臟中IFNφ1和IFNφ4基因表達一直處于下調(diào)狀態(tài)。實驗結(jié)果表明,斑馬魚IFNφ1和IFNφ4基因在抵抗病毒和細(xì)菌感染過程中發(fā)揮重要作用,IFNφ4抗病毒作用弱于IFNφ1基因。為了進一步研究IFNφ4功能,本實驗制備了IFNφ1和IFNφ4基因的多克隆抗體。以注射等體積PBS的斑馬魚為對照,對E.tarda和SVCV感染的斑馬魚腎臟、脾臟、鰓、腸四個組織進行免疫組化分析。實驗結(jié)果表明鯉春病毒能夠誘導(dǎo)斑馬魚IFNφ1和IFNφ4蛋白合成;E.tarda感染能抑制斑馬魚IFNφ1和IFNφ4蛋白合成。為了深入研究IFNφ1和IFNφ4參與的相關(guān)信號通路。通過原核表達制備IFNφ1和IFNφ4重組蛋白,分別用濃度為0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL的蛋白濃度孵育ZF4細(xì)胞(斑馬魚胚胎成纖維細(xì)胞)6 h,通過測定Mx基因轉(zhuǎn)錄水平,鑒定重組蛋白的活性和功能。實驗結(jié)果表明不同濃度IFNφ1和IFNφ4重組蛋白均能顯著上調(diào)Mx抗病毒基因表達水平。綜合實際情況,選用20ng/mL IFNφ1和IFNφ4重組蛋白濃度孵育ZF4細(xì)胞6 h對mRNA和miRNA進行轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示IFNφ1和IFNφ4蛋白共同上調(diào)966個mRNA基因和21個miRNA基因,共同下調(diào)548個mRNA基因和24個miRNA基因,共同上調(diào)和共同下調(diào)的信號通路上的基因十分相似,尤其是共同上調(diào)的信號通路上的基因。通過數(shù)據(jù)分析后選擇抗病毒,干擾素通路,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞因子等通路上的基因進行熒光定量驗證。結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測定結(jié)果一致。E.tarda感染斑馬魚,熒光定量和疫組化實驗都表明E.tarda降低斑馬魚IFNφ1和IFNφ4基因的表達。為了進一步驗證E.tarda對IFNφ1和IFNφ4的作用,通過E.tarda感染ZF4細(xì)胞6 h和24 h,通過熒光定量和Western blot分別檢測IFNφ1和IFNφ4基因的表達和蛋白合成情況。IFN實驗結(jié)果表明E.tarda能夠顯著上調(diào)ZF4細(xì)胞中IFNφ1和IFNφ4基因表達。對斑馬魚腹腔注射免疫刺激物、細(xì)菌和病毒病原制備的樣品,定量TNFα和TNFRSF1a轉(zhuǎn)錄水平,實驗結(jié)果表明TNFα和TNFRSF1a在魚類抵抗細(xì)菌和病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

3.2 熒光定量（qRT-PCR）表達分析3.2 健康魚 IFN 1 和 IFN 4 基因在不同組織中的表達取 30 尾健康斑馬魚，隨機分成三組，每組 10 尾。解剖后分別取肝、腎臟、腸、皮膚、鰓、心、肝、腦、肌肉，置于 1 mL Trizol 溶液中，組織破碎儀破碎 2min，提取總 RNA，，制備 cDNA 熒光定量模板。qPCR 檢測 IFN 1 和 IFN 4 基因的表達情況。實驗結(jié)果顯示 IFN 1 和 IFN 4 兩種基因在脾臟、肌肉、腎臟和心臟中表達相對較高，在鰓、肝、腸中表達量較低。00 5 10log(copy)圖 1-1 IFN 1、IFN 4 和 EF1α 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1-1 Standard curves of IFN 1, IFN 4 and EF1α genes

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 LPS 注射成年斑馬魚實驗為了研究 LPS 對 IFN 1 和 IFN 4 基因表達的影響，本實驗將每尾斑馬魚注射10 μL 100 μg/mL LPS 刺激物，在 12 h、24 h、48 h 和 72 h 時間點取脾臟和腎臟。提取總RNA、逆轉(zhuǎn)錄制備熒光定量模板、跑熒光定量PCR。數(shù)據(jù)處理同第一章2.7.2，用 graphpad prism 軟件進行作圖。結(jié)果顯示 LPS 注射后脾臟 48 h 和 72 h IFN 1 和IFN 4 基因表達顯著升高（圖 2-1a）。腎臟在 72 h 表達顯著上調(diào)（圖 2-1b）。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉春;李凱彬;王慶;任燕;石存斌;吳淑勤;;斑馬魚遲緩愛德華氏菌的鑒定、致病性及藥物敏感性[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2013年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 高昌;斑馬魚干擾素γ基因克隆表達及生物信息學(xué)分析[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

本文編號：2658981