【摘要】：弧菌是一類彎曲或直桿狀的革蘭氏陰性細菌,其中一些種類可以引起養(yǎng)殖動物的疾病,甚至可以引起人的疾病導致死亡。致病性弧菌擁有多種毒力因子,胞外蛋白酶是主要組成成分,對弧菌的致病性具有重要作用�；【毡閷Ζ�-內酰胺類抗生素具有抗性,主要機制之一是產生β-內酰胺酶,降解β-內酰胺類抗生素。本論文對鰻弧菌胞外蛋白酶Epp的PKD1結構域和副溶血弧菌β-內酰胺酶VPBL開展了結構與功能研究。胞外蛋白酶一般以酶原前體的形式表達出來,然后經(jīng)過多步加工成熟。金屬蛋白酶EmpA是鰻弧菌的一種重要毒力因子,其成熟需要該酶成功的分泌和加工,而一種蛋白酶Epp被發(fā)現(xiàn)可以促進胞外的pro-EmpA加工為成熟的EmpA。Epp與霍亂弧菌金屬蛋白酶PrtV具有高度的相似性,全長包含信號肽、N端結構域、M6金屬蛋白酶結構域和兩個PKD結構域(分別命名為PKD1和PKD2)。PrtV的PKD1的結構已經(jīng)被解析,Ca~(2+)可以通過結合PKD1結構,控制PrtV酶原的結構域連接區(qū)域靈活性來調節(jié)成熟過程。因此Epp也可能會通過PKD1結構受Ca2+調控成熟,但是具體激活機制完全未知。由于Epp的M6金屬蛋白酶結構域沒有獲得可溶性蛋白,因此本研究中我們只解析了鰻弧菌Epp蛋白酶的第一個PKD的結構(Epp-PKD1)以及研究了它Ca~(2+)結合的特異性。Epp-PKD1在溶液中以單體形式存在,結構主要是七個β-折疊構成的兩個β-片層,每個蛋白分子的N3、Q4、D27、D29、D68和一個水分子與Ca~(2+)形成五角雙錐體的構象。Ca~(2+)與apo Epp-PKD1孵育可以促進蛋白的熱穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性,而Mg~(2+)、Mn~(2+)和Zn~(2+)都不可以,顯示Epp-PKD1結合Ca~(2+)具有特異性。盡管Epp-PKD1與PrtV-PKD1在序列和結構上有高的同源性,但是兩者在多聚狀態(tài)和Ca~(2+)結合位點是不同的,說明PrtV和Epp受Ca~(2+)調控成熟是不同的。我們的研究有助于更好地理解PKD結構域介導的Ca~(2+)調控蛋白酶的成熟過程。β-內酰胺類抗生素是治療細菌感染使用最廣泛的抗生素,具有毒性小、成本低、抗菌活性廣、臨床療效好等優(yōu)點。然而,細菌會進化出各種耐藥性機制,阻礙其應用。染色體編碼的β-內酰胺酶是副溶血弧菌抗β-內酰胺類抗生素的主要原因,在這里我們首次解析了副溶血弧菌的A類β-內酰胺酶VPBL的晶體結構。VPBL結構由兩個結構域組成,一個是α/β結構域,包括5個反向平行的β折疊和3個α螺旋,另一個是主要由α螺旋組成的α結構域。活性位點位于兩個結構域之間,主要由四個保守序列_(70)STFK_(73)、_(130)SDN_(132)、_(166)ExxLN_(170)、_(234)KTG_(236)組成。與已知的A類β-內酰胺酶相比,VPBL包含一個保守的活性位點,但在遠離活性位點的位置存在氨基酸的差異,這在一定程度上影響酶的催化活性。與其他β-內酰胺酶和底物復合物的比較揭示了該酶對底物和抑制劑結合的偏好性,與酶活性相互印證。我們的結果支持了β-內酰胺酶抑制劑可與β-內酰胺類抗生素結合共同用于治療副溶血弧菌感染的這種新策略。同時我們進行定向進化研究了該酶的可塑性,發(fā)現(xiàn)VPBL具有較好的可塑性,可以通過氨基酸替換形成對抑制劑的抗性,這些突變可以協(xié)同作用增加抑制劑的抗性。因此仔細監(jiān)測酶突變對于β-內酰胺酶抑制劑與β-內酰胺類抗生素組合治療感染是必要的。β-內酰胺酶是該策略的關鍵,所以對β-內酰胺酶結構和可塑性的研究有助于β-內酰胺類抗生素和β-內酰胺酶抑制劑組合在治療弧菌中的應用。另一方面,這些結果也提供給我們結構信息來設計β-內酰胺類抗生素和抑制劑治療弧菌感染。
【圖文】：

基因、四環(huán)素耐藥基因 (Charles andAnthony, 2017)。（V.anguillarum）屬于弧菌屬、弧菌科，端生鞭毛，非孢子氧(Madigan et al., 2000; Buller, 2004)(圖 1.1)。該菌在含有 1.培養(yǎng)基上，在 25-30℃的溫度下可以快速生長，形成奶油色鰻弧菌分為兩種不同的生物類型 (1 型和 2 型) (Harrell et al技術的進步，鰻弧菌 2 型被重新歸類為新物種 Vibrio ordalii�；� 5S rRNA 基因序列分析，鰻弧菌 1 型被重新分類為 (MacDonell and Colwell, 1985)。然而，由于它與其他弧菌緊被稱為 V. anguillarum (Wiik et al., 1995)。例如，鰻弧菌與溶和費氏弧菌的 16SrRNA 基因顯示有超過 95%的相似性，這個屬的依據(jù) (Wiiket et al., 1995; Clarridge 2004)。

胞外的 pro-EmpA 加工成熟為 EmpA。基因 epp 編碼了一種 918 個氨基酸的酶，與先前報道的 V. cholerae 金屬蛋白酶 PrtV 和其他假定蛋白酶具有高度似性（如表 1.3）。PrtV 的成熟是由 Ca2+調控的 (Aaronetal.,2014)，，PrtV 的白酶原包含信號肽、N 端結構域、M6 金屬蛋白酶結構域和兩個 PKD 結構別命名為 PKD1 和 PKD2)（如圖 1.2）。PrtV 全長 102 kDa，分泌到胞外時信號肽和 PKD2 結構域形成 81 kDa 的形式，Ca2+調節(jié)蛋白水解形成 55kD性復合物，包含兩個 18 kDa 和 37 kDa 的蛋白鏈。PrtV 中 PKD 結構域的功不完全清楚，但 PrtV 的成熟需要除去兩個 PKD 結構域。PKD1 的結構已經(jīng)析，Ca2+可以通過結合 PKD1 結構，控制 PrtV 酶原的結構域連接區(qū)域靈活調節(jié)成熟過程 (Aaron et al., 2013)。PKD1 失去 Ca2+后與金屬蛋白酶結構域區(qū)域的柔韌性增加從而斷裂，使 PrtV 的金屬蛋白酶結構域結構進一步降解成熟，然而 PKD1 結構域的功能仍然不是很清楚，需要進一步研究。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院海洋研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S941.42

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1 李培海;弧菌金屬蛋白酶Epp和β-內酰胺酶VPBL的結構與功能研究[D];中國科學院大學(中國科學院海洋研究所);2018年

本文編號：2655832