【摘要】：轉座子(transposon)是一類可以在基因組中改變插入位置的遺傳因子,能夠通過水平轉移(horizontal transfer)的方式在自然界的不同物種間擴散傳播。轉座子所編碼的活性轉座酶能夠啟動其在生物體內的轉座過程,然而脊椎動物中的一些轉座子由于突變等原因大多數(shù)均已失去活性,成為了非自主性轉座子,從而不能完成整個轉座過程。2008年,在不同的金魚品系中通過篩選,最終獲得金魚Tgf2轉座子,它是繼第一類具有自主轉座活性的青溕Tol2之后的第二類具有自主轉座活性的轉座子,屬于hAT(hobo-AC-Tam)超家族。Tgf2轉座子能夠編碼完整、具有自主轉座活性的轉座酶,在魚類轉基因、基因捕獲等方面具有廣闊的應用前景。本實驗室從金魚胚胎中分離得到了7種不同的Tgf2轉座子mRNA轉錄本,同時得到了三種氨基酸長度分別為686、650和577的Tgf2轉座酶。目前這三種長度的轉座酶均已在E.coli中表達,為了進一步提高表達量及其表達穩(wěn)定性,依據(jù)大腸桿菌對密碼子的偏好性和簡并性對686長度的轉座酶密碼子進行了優(yōu)化。本研究目的則是利用pET28a(+)作為質粒載體,E.coli BL21(DE3)作為宿主菌,表達出密碼子優(yōu)化后的686長度Tgf2轉座酶,并研究能夠保存純化后的轉座酶穩(wěn)定性的方法。同時用含有不同重復序列數(shù)目的探針研究其DNA結合活性及特異性,從而為構建具有更高活性的轉座酶提供幫助。本實驗主要分為四個部分。第一部分為重組表達載體的構建,首先依據(jù)大腸桿菌對密碼子的簡并性和偏好性對金魚Tgf2轉座酶的密碼子進行優(yōu)化,優(yōu)化后的Tgf2轉座酶命名為Tgf2-TPase~(83)。用限制性內切酶Bam I和XholI分別對含有Tgf2-TPase~(83)基因序列的克隆載體和表達載體pET28a(+)雙酶切,用T_4 DNA連接酶將它們連接起來。根據(jù)轉座酶和載體的特點設計合適的引物,PCR檢測,用基因測序方法鑒定連接后的序列,序列對比結果表明,重組表達載體pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)構建成功。第二部分為重組載體pET28a(+)-Tgf2-TPase~(83)的原核表達、純化和質譜鑒定。本實驗中選擇BL21(DE3)作為表達的宿主菌,使得重組載體質粒在BL21(DE3)中表達,表達條件為溫度30℃、IPTG濃度1.0 mM、誘導時間6 h、轉速150 rpm,用SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析。實驗結果表明,在蛋白分子量大約為79.6 kDa處不但有相應的條帶出現(xiàn),而且表達后此處的蛋白條帶有明顯加深,所以目的蛋白表達成功。在SDS-PAGE中可以表達出可溶性蛋白,故我們采用反復凍融、超聲破碎、離心取上清的方法用His Trap~(TM) HP柱子對重組蛋白純化,分別用20 mM、40 mM、500 mM的咪唑對目的蛋白進行洗脫,將最終收集的純化樣品用SDS-PAGE分析,割膠并進行質譜鑒定。結果表明,密碼子優(yōu)化后的Tgf2-TPase~(83)表達量提高到了6.3%,純度提高到了85%。同時,質譜結果表明,重組蛋白Tgf2-TPase~(83)即為金魚Tgf2轉座酶。第三部分為重組蛋白Tgf2-TPase~(83)的保存穩(wěn)定性研究。本實驗中選取了四種不同的保存方法,分別為:加入20%甘油、直接凍干、加入凍干保護劑8%蔗糖和4%甘露醇后冷凍干燥,均置于-80℃中進行保存。用質粒pTgf2-EF1α-EGFP檢測分別保存7 d和14 d后Tgf2-TPase~(83)的DNase活性,用瓊脂糖凝膠電泳檢測,通過BandScan掃描,將質粒的變化情況進行量化處理,得到不同的消化速度。結果表明,以新鮮酶液的DNase活性作為對照,20%甘油有助于保存Tgf2-TPase~(83)酶活性,其他三種保存方法都沒有20%甘油的保存效果好。第四部分為重組蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA結合活性及其特異性研究。首先,對用20%甘油保存的Tgf2-TPase~(83)酶進行DNA結合活性研究;其次,金魚Tgf2轉座子的重復序列包括5’AGTAA3’和5’GTACT3’,我們從Tgf2轉座子左臂末端設計了四種含有不同重復序列數(shù)目的探針,分別為P_H,P_(M1),P_(M2),P_L,其中探針P_L中包含有與原始重復序列不同的堿基為5’GGTAA3’。實驗中我們用葡聚糖凝膠層析來判斷Tgf2-TPase~(83)是否具有DNA結合活性,主要是根據(jù)蛋白與探針結合后的紫外吸收值是否有增加。同時,用蛋清溶菌酶作為陰性對照,判斷Tgf2-TPase~(83)的DNA結合活性是否具有特異性。結果表明,用20%甘油保存7 d、14 d、30 d時的Tgf2-TPase~(83)酶是具有DNA結合活性的;含有不同重復序列數(shù)目的探針與重組蛋白Tgf2-TPase~(83)的DNA結合活性是不同的,重復序列數(shù)目越多,其結合活性越高。另外,陰性對照實驗結果表明,Tgf2-TPase~(83)的DNA結合活性是具有特異性的。通過密碼子優(yōu)化后的Tgf2轉座酶不僅增加了其表達量(6.3%),而且純化后其純度(85%)也得到了提高。采用原核表達系統(tǒng)獲得的可溶性重組蛋白Tgf2-TPase~(83)不僅為魚類轉基因提供了更加有效的手段,而且也促進了轉座子基因捕獲、基因捕獲和魚類遺傳育種等方面的應用。
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上海海洋大學碩士學位論文時出現(xiàn)差異，即為密碼子偏愛性。同時，也存在著一定的簡并性。從 19 中不同魚類物種和品系中篩選出來金魚 Tgf2 轉座子，其轉座酶（Tgf2-TPase）中含有一些稀有密碼子，使大腸桿菌難以識別，如 AGA，UCG，AGG 等。我們使用稀有密碼子分析工具（GeneScript Rare Codon Analysis Tool）可知：Tgf2-TPase 的密碼子使用頻率分布系數(shù)（Codon Frequency Distribution,CFD），GC 含量和密碼子適應指數(shù)（CodonAdaption Index,CAI）分別為：1%，51.28%和 0.83。參考大腸桿菌對密碼子的兩種特性，我們對 Tgf2-TPase 包含的稀有密碼子進行了優(yōu)化，如圖 1-1 所示，使得 CFD，CAI 和 GC 同時達到了理想區(qū)間指標。Tgf2-TPase 轉座酶包括 686個氨基酸，長度為 2061 bp，密碼子共優(yōu)化 83 處，19 種不同的氨基酸。

圖 1-2 Tgf2-TPase83的雙酶切電泳檢測A 標準分子量 marker；1：Tgf2-TPase83的雙 1-2 Double enzyme cutting detection of Tgf2-TP marker; 1: Double enzyme cutting product of Tg得本身含有的 XhoI 與 BamHI 酶切位點，用目的片段大小為 5369 bp。檢測電泳如行割膠回收。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;S917.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 鄒曙明;杜雪地;袁劍;蔣霞云;;金魚hAT家族轉座子Tgf2的克隆及其結構[J];遺傳;2010年12期

2 孫東坡,胡一橋;蛋白質冷凍干燥制品中的保護劑及其保護機制[J];藥學進展;2003年04期

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本文編號：2652764