【摘要】：作為促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)信號(hào)通路的重要的成分,GnRH受體(GnRHR)和GnRH結(jié)合,然后在刺激一系列的激素級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控性腺的發(fā)育中起到重要的作用。目前,本實(shí)驗(yàn)室已從中華絨螯蟹腦和卵巢轉(zhuǎn)錄組庫(kù)中篩選出GnRH信號(hào)通路的相關(guān)基因,篩選出的這些基因的序列與大多數(shù)昆蟲類以及其他甲殼類動(dòng)物的基因序列有較高的相似性。并且,我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功分離出中華絨螯蟹GnRH類似物。目前,關(guān)于中華絨螯蟹GnRHR基因的研究仍為空白。同時(shí)為了研究在無脊椎動(dòng)物中GnRHR的分子機(jī)制以及潛在GnRH信號(hào)通路,本實(shí)驗(yàn)選取了我國(guó)重要的水產(chǎn)類品種中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)作為對(duì)象,研究在無脊椎甲殼動(dòng)物中促性腺激素釋放激素受體的分子鑒定和表達(dá)。在為了檢測(cè)GnRHR分布特征,本實(shí)驗(yàn)中,首先在中華絨螯蟹Eriocheir sinensis(命名為EsGnRHR)中克隆得到了GnRHR cDNA序列并對(duì)其表達(dá)特征進(jìn)行了分析。EsGnRHR全長(zhǎng)為2038 bp,包括一個(gè)1566 bp的開放閱讀框,57 bp的5′端非編碼區(qū)和415 bp的3′端非編碼區(qū)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示EsGnRHR蛋白質(zhì)包括7個(gè)跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域,該特征符合在脊椎動(dòng)物中已經(jīng)鑒定得出的促性腺激素釋放激素受體。聚類進(jìn)化樹分析說明中華絨螯蟹促性腺激素釋放激素受體和無脊椎動(dòng)物日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的親緣關(guān)系比較近。其次RT-PCR檢測(cè)了EsGnRHR基因在中華絨螯蟹成體中各個(gè)組織中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EsGnRHR表達(dá)主要分布在胸神經(jīng)團(tuán)、卵巢中,有少量分布在精巢和腦中。然后原位雜交驗(yàn)證EsGnRHR mRNA的分布,EsGnRHR mRNA雜交信號(hào)主要分布在腦組織的前部和中部。在卵巢組織中,信號(hào)主要分布在卵黃發(fā)生前期的細(xì)胞質(zhì)和卵黃發(fā)生期細(xì)胞中的分散細(xì)胞質(zhì)中;同時(shí)在精巢組織中,EsGnRHR mRNA主要分布在精巢的精母細(xì)胞和精母細(xì)胞中,這些結(jié)果顯示GnRHR基因確實(shí)存在于中華絨螯蟹體內(nèi)。最后實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同的性腺發(fā)育的階段的表達(dá)情況,EsGnRHR mRNA的表達(dá)量在精巢和卵巢發(fā)育時(shí)期中的數(shù)據(jù)說明EsGnRHR參與調(diào)控性腺的發(fā)育。最后,熒光定量分析注射中華絨螯蟹GnRH類似物多肽對(duì)EsGnRHR mRNA表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,EsGnRHR表達(dá)水平在雄性中華絨螯蟹在15 d(day)出現(xiàn)顯著性差異,雌性中華絨螯蟹中在24 h(hour)和7 d時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異,這些數(shù)據(jù)說明GnRH多肽類似物能夠刺激EsGnRHR的表達(dá)�？傊�,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一次證明了GnRHR存在于中華絨螯蟹中。對(duì)EsGnRHR基因分子特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析,并對(duì)其與其他物種的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了研究。EsGnRHR mRNA分布在胸神經(jīng)和性腺。進(jìn)一步的研究證明,EsGnRHR mRNA在精巢整個(gè)發(fā)育時(shí)期,卵巢的早、中期有表達(dá),說明了EsGnRHR具有多種功能。雖然需要進(jìn)一步的探索,但是我們關(guān)于EsGnRHR的研究為中華絨螯蟹腦-胸神經(jīng)團(tuán)-性腺軸的研究提供了理依據(jù)。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文兩者的中間部分 933 bp 如圖 1-1，使用拼接和 RACE 方法，我們從中華絨螯蟹的腦和卵巢中克隆得到了 GnRHRcDNA。利用 BCNI 進(jìn)行 BLAST，結(jié)果顯示為中華絨螯蟹 GnRHR 基因。最終確定 cDNA 的全長(zhǎng)為 2038 bp,包括 57 bp 的 3′-UTR 和5′-UTR 415 bp 的 UTR，包括得到了 1566 bp 得 ORF，編碼 521 個(gè)氨基酸，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的拼接全長(zhǎng)的正確性，設(shè)計(jì) F 和 R 引物，PCR 擴(kuò)增PCR 的擴(kuò)增結(jié)果為 1000-2000bp 左右，符合全長(zhǎng)的大小,送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，證明為 GnRHR 基因的序列。

白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析線工具 ProtParam 預(yù)測(cè)中華絨螯蟹 GnRHR 的理編碼 521 個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量為 59451.62Da數(shù)為 50.53。溶脂數(shù)為 90.9，總平均疏水指數(shù) 0.07具NetPHos2.0預(yù)測(cè)GnRHR蛋白質(zhì)的潛在得磷酸化9 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，4 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)以及RED 在線網(wǎng)址預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域?qū)χ腥A絨螯蟹 GnRH，結(jié)果如圖 1-7 所示，存在 7 個(gè)分值大于 0 的峰，，分別為位于 1-17、33-54、71-88、107-127、16氨基酸。另外，，中華絨螯蟹 GnRHR 基因的第三和-x-G/S 氨基酸調(diào)控位點(diǎn)，這表明該受體基因或許還跨膜結(jié)構(gòu)域。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2652396