【摘要】：對生活在極端寒冷下的魚類而言,如何避免受到寒冷環(huán)境的傷害是一個極其重要的問題。南極Notothenioids魚類之所以能在南極極端寒冷的環(huán)境下生存,并成為南極海域主要的魚類物種,是因為其成魚體內(nèi)含有高濃度的抗凍糖蛋白(AFGPs),但是在南極Notothenioids魚類的魚卵和幼魚體內(nèi)AFGPs的表達(dá)水平非常低,甚至沒有表達(dá),南極Notothenioids魚類的魚卵和幼魚是怎樣避免寒冷傷害還未可知。Zona pellucida(ZP)蛋白基因家族編碼一類參與識別精卵的卵殼蛋白,已有研究發(fā)現(xiàn)在南極Notothenioids魚類中許多類型的ZP基因發(fā)生了特異性的大規(guī)模擴增。本研究發(fā)現(xiàn)南極魚ZP蛋白具有冰晶結(jié)合活性,并修飾冰晶生長的形態(tài),使含南極魚ZP蛋白溶液的冰晶呈規(guī)則的六棱柱形狀,并且使該溶液的熔點降低,促進(jìn)冰晶的溶化。所以南極魚ZPs是一類冷脅迫相關(guān)蛋白,能與AFPs共同作用,使南極魚類在-1.9℃的寒冷環(huán)境下生存,并避免冰晶對南極魚魚體的機械傷害。ZP蛋白具有的冰晶結(jié)合活性是一種固有的原始功能,還是只是在南極Notothenioids魚類ZP蛋白所特有的功能呢?所以我們選擇了與南極魚生活環(huán)境相似的齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti,SP)的ZP蛋白(SP_ZP3)進(jìn)行研究,齊口裂腹魚也是一種寒冷環(huán)境下生活的物種,其分布水域的特點是海拔高、氣溫低。研究發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚的ZP蛋白具有弱的冰晶結(jié)合活性,但不能降低溶液的冰點。本研究主要通過RT-PCR的方法,從南極Notothenioids魚類和齊口裂腹魚卵巢的總RNA中克隆得到多種zona penucida基因的編碼區(qū),并構(gòu)建這些基因的真核表達(dá)載體,然后在中國倉鼠的卵巢細(xì)胞(CHO-K1)中進(jìn)行表達(dá),并用分離純化得到的ZP蛋白進(jìn)行冰晶實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZP蛋白溶液的冰晶形狀呈規(guī)則六棱柱,證明ZP蛋白能與冰晶進(jìn)行結(jié)合,并改變了冰晶的生長形態(tài),具有冰晶結(jié)合活性。ZP蛋白是包含ZP結(jié)構(gòu)域的一類蛋白,存在于所有的脊椎動物中。該蛋白基因鐫刻著進(jìn)化的歷史,ZP基因無論是在低等生物(如線蟲)還是在高等哺乳動物中都有分布,該基因在魚類中被稱為卵殼蛋白基因,在高等哺乳動物中被叫作透明帶蛋白基因。ZP蛋白作為卵細(xì)胞外膜的重要組成部分參與了的受精過程,研究表明,參與該過程的基因進(jìn)化速度要比其他基因快。南極Notothenioids魚類的ZP基因在寒冷條件下大量擴增,是南極魚適應(yīng)南極極端寒冷環(huán)境的重要機制,ZP基因的擴增又加快了ZP基因的進(jìn)化,使其進(jìn)化成為一類冷脅迫蛋白,使南極魚類適應(yīng)極端寒冷的水環(huán)境。而本研究顯示SP_ZP3蛋白有冰晶結(jié)合活性,這種活性可能是生活在寒冷環(huán)境下魚類ZP蛋白的一種原始功能,而在南極Notothenioids魚類中,這種功能在高強度的寒冷壓力下會被持續(xù)放大,獲得了明顯降低熔點的功能。
【圖文】：

受態(tài)細(xì)胞：大腸桿菌 XL10-Gold，DH-5α；養(yǎng)細(xì)胞系：CHO-K1 細(xì)胞系，ATCC Number: CCL-61 ；表 2.2.3 實驗所用的南極魚類樣品及采集的位置Species Family Locality （latitude, longitude）raco hamatus Channichthyidae Pryz Bay （68°36′S, 78.0°E）tichus mawsoni Nototheniidae McMurdo Sound, Ross Sea（77°51.0′S ,166°4draco acuticeps Bathydraconidae Zhongshan Station, Antarctica（69°22.0′S,76°2實驗的方法和步驟Zona pellucida 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 pIRES2-EGFP 載體的示意圖

圖 2.1.1-1 齊口裂腹魚卵巢總 RNA 的電泳和 SP_ZP3 的克�。╝. 卵巢總 RNA 的電泳檢測；b. SP-ZP3 基因的 RT-PCR 結(jié)果；c. 用 M13 引物對 T-SP_ZP3 載體的菌落 PCR 驗證）ig 2.1.1-1 Electrophoresis of total RNA of Schizothorax prenanti and cloning of SP_Z對獲得的基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明：該基因所編碼的蛋白質(zhì)分子055，其等電點 pI 的理論值為 8.63。通過 SMART 軟件預(yù)測，該蛋白質(zhì)基酸到 31 個氨基酸為信號肽序列，，第 133 aa 至 384 aa 之間有個保守的--透明帶結(jié)構(gòu)域（Zona pellucida domain），第 430 aa 到 444 aa 之間為域（表圖 3.1.1-2）。根據(jù) SP-ZP3 基因的序列，從 NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載其種的氨基酸同源序列，使用 MEGA 5.1 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果（，Zona pellucida 3 基因在魚類中較為保守，齊口裂腹魚（Schizothorax pr他魚類（鯽魚 Carassius auratus，鯉魚 Cyprinus carpio，黑頭軟口鰷 Pimelas，翹嘴湆 Culter alburnus，稀有泩鯽 Gobiocypris rarus，斑馬魚 Danio緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：2651835