【摘要】：殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida,A.salmonicida),作為最主要的一種可以引起魚(yú)體癤瘡病的細(xì)菌,正影響著全世界范圍內(nèi)的鮭科魚(yú)類的養(yǎng)殖,尤其是大西洋鮭(Salmo salar)的養(yǎng)殖。為了增加我們對(duì)這個(gè)病原菌的了解,同時(shí)從大西洋鮭體內(nèi)篩選出可以用來(lái)抵抗該病菌侵襲的潛在生物指示因子,我們采用代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)學(xué)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析和篩選。由于該細(xì)菌主要發(fā)病的器官是魚(yú)體的重要免疫器官-腎臟組織。因此,我們將腎臟作為本實(shí)驗(yàn)研究的主體。另外,我們從實(shí)驗(yàn)分析的組學(xué)數(shù)據(jù)中篩選出醛脫氫酶家族的7A1蛋白(ALDH7A1),并將其進(jìn)行蛋白重組表達(dá)純化。發(fā)現(xiàn)其在大西洋鮭感染殺鮭氣單胞菌的早期,有著明顯的抗殺鮭氣單胞菌的能力并且可以顯著降低魚(yú)體的死亡率。所有得到的主要結(jié)果如下所示:1代謝組學(xué)對(duì)感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析本部分實(shí)驗(yàn)中,我們首次通過(guò)~1H核磁共振(NMR)光譜分析法來(lái)分析感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織中代謝物的變化情況。通過(guò)NOESYPR1D光譜、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)兩種多元化分析(劉鵬飛,2015),對(duì)7天和14天的高濃度感染實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中的實(shí)驗(yàn)大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行比較分析。本部分實(shí)驗(yàn)最主要的目的就是篩選出可以抵抗殺鮭氣單胞菌感染魚(yú)體的重要代謝物,同時(shí)進(jìn)一步了解該病菌在大西洋鮭體內(nèi)的致病機(jī)理。經(jīng)分析,我們發(fā)現(xiàn)分布在TCA循環(huán)、糖酵解/糖異生、色氨酸代謝和尿素循環(huán)等四大代謝通路中的延胡索酸鹽、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、天冬氨酸鹽、膽堿、磷酸膽堿和甜菜堿等9種差異代謝物,可能是由于殺鮭氣單胞菌的刺激和影響,而在魚(yú)體內(nèi)出現(xiàn)明顯增高的表達(dá)趨勢(shì)。2蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ標(biāo)記法),對(duì)在7天和14天兩個(gè)高、低濃度不同的感染殺鮭氣單胞菌的實(shí)驗(yàn)組中的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析和鑒定。我們通過(guò)LC/MS/MS質(zhì)譜儀分析后共篩選出4009個(gè)總蛋白。隨后,我們將140個(gè)差異極顯著的蛋白(差異倍數(shù)≥1.5和P0.01)進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析,共篩選出39個(gè)蛋白可以作為大西洋鮭抵抗殺鮭氣單胞菌侵襲的潛在生物指示因子。然后,我們從中篩選了9個(gè)重要的差異蛋白進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR來(lái)檢驗(yàn)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與蛋白水平變化基本相同。本實(shí)驗(yàn)是第一次通過(guò)iTRAQ技術(shù)對(duì)感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析鑒定,最終我們推測(cè)甘油醛-3-磷酸脫氫酶、醛脫氫酶家族7A1、醛脫氫酶家族9A1、L-乳氨酸脫氫酶B鏈、羥烷基-輔酶A脫氫酶、β-血紅蛋白亞基、α-4-血紅蛋白亞基、T-復(fù)合蛋白1-eta亞基、磷酸丙糖異構(gòu)酶-A和補(bǔ)體因子B等10個(gè)蛋白可作為潛在的生物指示因子進(jìn)行深入研究。3 ALDH7A1蛋白可以保護(hù)大西洋鮭抵抗殺鮭氣單胞菌醛脫氫酶家族(ALDHs)是一個(gè)具有解毒功能的超級(jí)蛋白家族,同時(shí)該家族蛋白在維持上皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),并保護(hù)細(xì)胞免受醛類毒素的影響和抗藥性上有著重要的作用。然而,對(duì)于這些解毒蛋白如何行使功能,我們至今還無(wú)從得知。在本部分的研究中,我們表達(dá)并純化了ALDH7A1蛋白來(lái)研究其在感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭時(shí)的作用。我們首先通過(guò)SDS-PAGE和western blot的方法來(lái)驗(yàn)證重組表達(dá)的ALDH7A1(rALDH7A1)蛋白。該蛋白分子量大概為58.9 kDa,等電點(diǎn)為7.09,且該重組蛋白并無(wú)信號(hào)肽分子,而氨基酸序列中只有一個(gè)低復(fù)雜區(qū)域(~14141 yvegvgevqeyvdv ~(153))。另外,ELISA的結(jié)果表明,rALDH7A1可以與殺鮭氣單胞菌結(jié)合。且ALDH7A1的基因在魚(yú)的腎臟、肝臟、腸、和血液中表達(dá)最高(依次降低),而在鰓和脾中表達(dá)最低。隨后再通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn)大西洋鮭的腎臟組織后,我們發(fā)現(xiàn)注射rALDH7A1蛋白的感染殺鮭氣單胞菌的實(shí)驗(yàn)組中,在感染早期,殺鮭氣單胞菌的拷貝數(shù)明顯低于同濃度的感染實(shí)驗(yàn)組。與此同時(shí),我們測(cè)定了在腎臟和脾臟組織中,NF-kB、P-38 MAPK、caspase-3和TNF-α等4個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明,主要在72 h的rALDH7A1+高/低濃度感染組的腎臟和肝臟中,這4個(gè)基因受到rALDH7A1蛋白的作用表達(dá)量明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組,而在脾臟組織中則是在12 h時(shí),在rALDH7A1+高/低濃度感染組中出現(xiàn)與72 h相同的變化趨勢(shì)。再通過(guò)體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)rALDH7A1+高/低濃度感染組中的魚(yú)與BSA和PBS對(duì)照組相比,魚(yú)的死亡率會(huì)降低并出現(xiàn)明顯延后致死的情況。4磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的腎臟組織進(jìn)行分析本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)磷酸化蛋白質(zhì)組對(duì)感染細(xì)菌時(shí)顯著差異表達(dá)的蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行分析。這是首次對(duì)感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的鑒定。經(jīng)分析,共有3112個(gè)蛋白含5635個(gè)磷酸化位點(diǎn)被鑒定到,并以1.5倍差異倍數(shù)為基礎(chǔ),共鑒定到1502個(gè)上調(diào)蛋白和77個(gè)下調(diào)蛋白。再結(jié)合之前得到的蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)以及基序(motif)分析,我們推測(cè)5個(gè)在免疫過(guò)程和細(xì)胞通路中調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨架的激酶(VRK3,GAK,HCK,PKCδ和RSK6)可以作為研究大西洋鮭抵抗殺鮭氣單胞菌侵襲的潛在生物因子。另外,通過(guò)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖分析,我們發(fā)現(xiàn)fga在整個(gè)蛋白網(wǎng)絡(luò)的最中心部位,同樣可能在感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭體內(nèi)起著重要的調(diào)控作用。
【圖文】：

圖 1.1 感染殺鮭氣單胞菌的大西洋鮭的癥狀。Fig. 1.1 Symptom in Atlantic salmon infected by A. salmonicida.1.2. 殺鮭氣單胞菌在大西洋鮭中的研究進(jìn)展1.2.1. 殺鮭氣單胞菌致病機(jī)制研究之前有研究表明，III 型分泌系統(tǒng)（TTSS）是引起殺鮭氣單胞菌在大西洋鮭中致病性毒力因子（Burr et al.，2002；Dacanay et al.，2003；Dacanay et al.，2006；Vipond et al.，，1998）。TTSS 主要是通過(guò)產(chǎn)生一種效應(yīng)因子，將細(xì)菌從細(xì)胞質(zhì)中直接導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的胞液中（He et al.，2004）。隨后，當(dāng)攜帶 TTSS 細(xì)菌與宿主中的巨噬細(xì)胞相結(jié)合后，該效應(yīng)因子可以抑制巨噬細(xì)胞細(xì)胞信號(hào)通路，從而

多組學(xué)研究大西洋鮭抵御殺鮭氣單胞菌的分子機(jī)制(4) 通過(guò)磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，對(duì)高濃度（107CFU/mL）感染殺鮭氣單胞菌 7 天時(shí)的大西洋鮭的感染組和對(duì)照組的腎臟組織進(jìn)行比較，篩選出感染組中重要的磷酸化差異蛋白質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)。本文的技術(shù)路線如圖 1.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S941.42

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本文編號(hào)：2635533