【摘要】：本論文以軍曹魚為研究對象,采用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR),成功克隆了軍曹魚類胰島素生長因子-I(Insulin-like Growths Factors-I,IGF-I)基因序列,并對該基因序列進行生物信息學分析和功能鑒定,同時研究了不同飼料糖水平對軍曹魚IGF-I基因組織特異性表達的影響,進而通過質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建了軍曹魚IGF-I體外原核表達系統(tǒng),并成功獲得重組蛋白,為深入研究IGF-I基因?qū)姴荇~的成長和代謝調(diào)控,提供了堅實的理論基礎和科學依據(jù)。實驗結(jié)果如下:1.軍曹魚類胰島素生長生長因子-I(IGF-I)cDNA克隆和序列分析根據(jù)已經(jīng)克隆出的鱸形目魚類IGF-I基因序列設計簡并引物,采用PCR技術(shù)成功克隆了軍曹魚類胰島素生長因子-I序列。其cDNA序列長558bp,編碼185個氨基酸,其中信號肽含有44個氨基酸,成熟肽含有67個氨基酸,IGF-I mRNA屬于Ea-4亞型。預測分子量為8.58 kDa,理論等電點為7.4。同源氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn),軍曹魚IGF-I成熟肽結(jié)構(gòu)和人類一樣,都包括B、C、A、D區(qū),其中B區(qū)和A區(qū)保守性較高,C區(qū)和D區(qū)保守性較差。軍曹魚IGF-I基因與人類的同源性高達74%,與黃鰭棘鯛的同源性高達99%。采用泊松校正法構(gòu)建的IGF-I系統(tǒng)進化樹表明,軍曹魚IGF-I跟海洋魚類親緣性較近,跟淡水魚類和無脊椎動物親緣性較遠。通過實時熒光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)方法,檢測分析IGF-I基因在軍曹魚5個組織中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-I基因在軍曹魚肝臟中表達量最高,在其他組織較低。2.軍曹魚類胰島素生長因子-I原核表達系統(tǒng)構(gòu)建根據(jù)分析得到的軍曹魚IGF-I成熟肽序列設計引物,克隆得到軍曹魚IGF-I成熟肽,采用pEASY無縫克隆技術(shù)將其克隆到pEASY載體上構(gòu)建pEASY-IGF-I重組質(zhì)粒,測序正確后,插入表達載體pET-21a,轉(zhuǎn)化到表達菌株Rosetta(DE3)pLysS中進行表達,經(jīng)IPTG誘導后,表達菌液產(chǎn)生重組蛋白。通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)其為分子量為8.6kDa的蛋白條帶,經(jīng)過western blot檢測后發(fā)現(xiàn)目的蛋白與His抗體特異性結(jié)合,表明目的基因IGF-I在大腸桿菌中成功表達。產(chǎn)物以包涵體形式存在,可溶性較差,通過鹽酸胍變性,His-Tag純化和醋酸鈉洗脫復性得到可溶性體外重組的目的蛋白。3.軍曹魚進食不同糖水平飼料對IGF-I基因組織表達的影響以糊精為糖源設置三種不同糖水平的飼料飼喂軍曹魚,養(yǎng)殖八周后通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測IGF-I在各組織中的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中糖組(21%,M),肝臟中IGF-I的表達量是腸道的13倍左右,而低糖組(7%,L)和高糖組(35%,H)的表達量分別是腸道的75倍和470倍,可以得出飼料中糖含量的過高和過低都能影響IGF-I基因在肝臟中的正常表達。
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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1 孫穎;林浩然;;基因重組草魚生長激素(r-gGH)對草魚魚種生長的促進作用[J];水產(chǎn)學報;2006年06期

2 華益民,林浩然,鐘翎;用RNase保護法定量檢測鯉魚組織IGF-ImRNA的表達[J];中山大學學報(自然科學版);1998年04期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 錢q;花鱸類胰島素生長因子及結(jié)合蛋白基因的克隆與表達調(diào)控[D];中國海洋大學;2013年

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本文編號：2631755