【摘要】：本論文以軍曹魚為研究對象,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR),成功克隆了軍曹魚類胰島素生長因子-I(Insulin-like Growths Factors-I,IGF-I)基因序列,并對該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能鑒定,同時研究了不同飼料糖水平對軍曹魚IGF-I基因組織特異性表達(dá)的影響,進(jìn)而通過質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建了軍曹魚IGF-I體外原核表達(dá)系統(tǒng),并成功獲得重組蛋白,為深入研究IGF-I基因?qū)姴荇~的成長和代謝調(diào)控,提供了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.軍曹魚類胰島素生長生長因子-I(IGF-I)cDNA克隆和序列分析根據(jù)已經(jīng)克隆出的鱸形目魚類IGF-I基因序列設(shè)計簡并引物,采用PCR技術(shù)成功克隆了軍曹魚類胰島素生長因子-I序列。其cDNA序列長558bp,編碼185個氨基酸,其中信號肽含有44個氨基酸,成熟肽含有67個氨基酸,IGF-I mRNA屬于Ea-4亞型。預(yù)測分子量為8.58 kDa,理論等電點(diǎn)為7.4。同源氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn),軍曹魚IGF-I成熟肽結(jié)構(gòu)和人類一樣,都包括B、C、A、D區(qū),其中B區(qū)和A區(qū)保守性較高,C區(qū)和D區(qū)保守性較差。軍曹魚IGF-I基因與人類的同源性高達(dá)74%,與黃鰭棘鯛的同源性高達(dá)99%。采用泊松校正法構(gòu)建的IGF-I系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,軍曹魚IGF-I跟海洋魚類親緣性較近,跟淡水魚類和無脊椎動物親緣性較遠(yuǎn)。通過實(shí)時熒光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)方法,檢測分析IGF-I基因在軍曹魚5個組織中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-I基因在軍曹魚肝臟中表達(dá)量最高,在其他組織較低。2.軍曹魚類胰島素生長因子-I原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建根據(jù)分析得到的軍曹魚IGF-I成熟肽序列設(shè)計引物,克隆得到軍曹魚IGF-I成熟肽,采用pEASY無縫克隆技術(shù)將其克隆到pEASY載體上構(gòu)建pEASY-IGF-I重組質(zhì)粒,測序正確后,插入表達(dá)載體pET-21a,轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta(DE3)pLysS中進(jìn)行表達(dá),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,表達(dá)菌液產(chǎn)生重組蛋白。通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)其為分子量為8.6kDa的蛋白條帶,經(jīng)過western blot檢測后發(fā)現(xiàn)目的蛋白與His抗體特異性結(jié)合,表明目的基因IGF-I在大腸桿菌中成功表達(dá)。產(chǎn)物以包涵體形式存在,可溶性較差,通過鹽酸胍變性,His-Tag純化和醋酸鈉洗脫復(fù)性得到可溶性體外重組的目的蛋白。3.軍曹魚進(jìn)食不同糖水平飼料對IGF-I基因組織表達(dá)的影響以糊精為糖源設(shè)置三種不同糖水平的飼料飼喂軍曹魚,養(yǎng)殖八周后通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測IGF-I在各組織中的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中糖組(21%,M),肝臟中IGF-I的表達(dá)量是腸道的13倍左右,而低糖組(7%,L)和高糖組(35%,H)的表達(dá)量分別是腸道的75倍和470倍,可以得出飼料中糖含量的過高和過低都能影響IGF-I基因在肝臟中的正常表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫穎;林浩然;;基因重組草魚生長激素(r-gGH)對草魚魚種生長的促進(jìn)作用[J];水產(chǎn)學(xué)報;2006年06期

2 華益民,林浩然,鐘翎;用RNase保護(hù)法定量檢測鯉魚組織IGF-ImRNA的表達(dá)[J];中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1998年04期

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1 錢q;花鱸類胰島素生長因子及結(jié)合蛋白基因的克隆與表達(dá)調(diào)控[D];中國海洋大學(xué);2013年

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本文編號：2631755