【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是膜蛋白受體家族中的一大類群,也是細(xì)胞表面受體家族中成員最多的一類受體。它通過與G蛋白結(jié)合將細(xì)胞外信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的媒介分子。GPCR參與了生物體內(nèi)包括視覺、味覺、嗅覺、情緒的調(diào)節(jié)、行為的控制、神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、內(nèi)分泌系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等多種重要的生理活動。因此,GPCR常被作為藥物的靶標(biāo)分子被廣泛應(yīng)用于各種制藥工業(yè)中。在生物體內(nèi),大部分GPCR都屬于其家族分類中的A類視紫紅質(zhì)家族。而在視紫紅質(zhì)家族中,以章魚胺受體、酪胺受體、多巴胺受體、腎上腺素受體和血清素受體為代表的生物胺類受體參與到了包括脊椎動物和無脊椎動物在內(nèi)的多種生物的重要生命活動過程中,因而獲得了廣泛的關(guān)注和深入的研究。生物胺類受體是一類能夠與生物胺相結(jié)合的GPCR。生物胺廣泛存在于動植物體內(nèi)以及各種食品中,是含氮的具有生物活性的一類有機(jī)化合物。生物胺的分子量一般都比較小,但是可以參與到生物體的生長、發(fā)育、生殖等眾多的重要生理活動中,是具有潛在效應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)分子。作為無脊椎動物中常見的生物胺,章魚胺(octopamine,OA)和它的前體物質(zhì)酪胺(tyramine,TA)參與到了無脊椎動物的諸如生殖、性成熟、變態(tài)等眾多的發(fā)育過程中,并在其中扮演著非常重要的角色。雖然OA首先在軟體動物章魚中被發(fā)現(xiàn),目前針對于OA、TA以及OA/TA受體的研究工作主要集中于蛻皮動物特別是各種昆蟲中。而在貝類等軟體動物中,針對OA、TA以及OA/TA受體的研究則較少,它們在貝類等軟體動物體內(nèi)所發(fā)揮的生理功能目前也不清楚。在本文中,我們主要開展了對OA/TA受體在海洋貝類長牡蠣(Crassostrea gigas)不同發(fā)育時期中的生理功能研究。一、長牡蠣中潛在G蛋白偶聯(lián)受體的家族分類及表達(dá)譜分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前已經(jīng)測序獲得的長牡蠣的全基因組序列數(shù)據(jù),我們對已注釋的長牡蠣基因組序列進(jìn)行了初步篩選,共獲得了553條潛在的GPCR序列。隨后,通過對這些潛在的GPCR序列進(jìn)行疏水性跨膜區(qū)分析和結(jié)構(gòu)域篩選,最終鑒定出了412條GPCR序列。通過BLAST同源比對和系統(tǒng)發(fā)育分析,確定了這412條序列的家族分類情況:其中308條GPCR屬于A類受體家族,44條GPCR屬于B類受體家族,14條GPCR屬于C類受體家族,另外還有46條GPCR序列屬于未知的GPCR蛋白家族。此外,通過對長牡蠣中A類GPCR家族的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析我們還發(fā)現(xiàn),在長牡蠣的A類GPCR家族中,至少有36條GPCR序列屬于生物胺類受體亞家族。隨后,通過對這36個潛在生物胺類受體在長牡蠣不同發(fā)育時期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析,我們將長牡蠣中大多數(shù)潛在生物胺類受體的表達(dá)模式進(jìn)行了初步分類,大體分成了四種類型:(1)在長牡蠣的整個發(fā)育過程中,GPCR幾乎沒有表達(dá)或者表達(dá)量極低;(2)GPCR主要在長牡蠣的早期發(fā)育階段表達(dá);(3)GPCR主要在長牡蠣的中期發(fā)育階段表達(dá);(4)GPCR主要在長牡蠣的個別發(fā)育時期中特異性表達(dá)。尤其是在第4種類型中,我們還篩選鑒定出了兩個能夠在長牡蠣的眼點(diǎn)幼蟲期特異性上調(diào)表達(dá)的新型生物胺類受體——CGI_10017568和CGI_10027100,這兩個受體蛋白有可能參與到了長牡蠣的附著變態(tài)發(fā)育過程中。二、新型章魚胺/酪胺受體CgGPR1在長牡蠣不同發(fā)育時期中的功能研究通過PCR擴(kuò)增和RACE技術(shù),我們從長牡蠣中克隆得到了一個潛在的OA/TA受體蛋白CgGPR1(CGI_10017568)。CgGPR1基因全長為2,826 bp,編碼一個含有524個氨基酸的受體蛋白。BLAST結(jié)果顯示,CgGPR1與來自椎實(shí)螺Lymnaea stagnalis的章魚胺受體OAR2同源性最高。同源多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,CgGPR1屬于一個研究較少的無脊椎動物新型OA/TA受體亞家族。隨后,通過qPCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)和整體免疫熒光定位技術(shù)研究了CgGPR1在長牡蠣不同發(fā)育時期和不同成體組織中的時空表達(dá)模式。結(jié)果顯示,CgGPR1在長牡蠣從卵細(xì)胞期發(fā)育到稚貝的所有階段中都有表達(dá),在原腸胚期、擔(dān)輪幼蟲期和D型幼蟲期的表達(dá)水平最高,這表明CgGPR1可能參與了長牡蠣的胚胎發(fā)生和組織分化過程。CgGPR1的免疫熒光信號主要出現(xiàn)在長牡蠣幼蟲的面盤、足、鰓和外套膜處,這表明CgGPR1可能在長牡蠣幼蟲的游動、濾食以及感應(yīng)外界環(huán)境等生理過程中發(fā)揮著重要的作用;在長牡蠣眼點(diǎn)幼蟲期的足表面檢測到了CgGPR1的免疫熒光信號,這也表明CgGPR1可能在長牡蠣的附著變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著潛在的作用。在長牡蠣所有檢測的成體組織中,均檢測到CgGPR1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,在外套膜中的轉(zhuǎn)錄水平最高,在性腺中的轉(zhuǎn)錄水平最低,這暗示著CgGPR1可能在長牡蠣的成體組織中也發(fā)揮著一定的作用。此外,通過構(gòu)建能夠穩(wěn)定過表達(dá)CgGPR1的HEK293細(xì)胞株,我們還研究了生物胺類神經(jīng)遞質(zhì)(激動劑)對可穩(wěn)定過表達(dá)CgGPR1的HEK293細(xì)胞內(nèi)第二信使分子cAMP和Ca~(2+)水平的影響。結(jié)果顯示,OA、TA以及其他相關(guān)的生物胺類物質(zhì)不能引起可表達(dá)CgGPR1的HEK293細(xì)胞內(nèi)cAMP和Ca~(2+)的濃度發(fā)生變化,這說明CgGPR1及其所代表的第四亞家族無脊椎動物OA/TA受體蛋白可能并不參與cAMP和Ca~(2+)所介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,而是參與了其他未知的信號分子所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們對CgGPR1的研究為后續(xù)進(jìn)一步地開展對CgGPR1及其近源蛋白在無脊椎動物中的生理功能的研究奠定了良好的基礎(chǔ),也為后續(xù)人工干預(yù)或調(diào)控海洋貝類等污損生物的附著變態(tài)過程提供了潛在的靶標(biāo)分子。三、新型酪胺受體CgTAR1在長牡蠣不同發(fā)育時期中的時空表達(dá)模式分析我們還從長牡蠣中克隆了一個潛在的TA受體蛋白CgTAR1(CGI_10027100)。CgTAR1基因全長為1,601 bp,編碼一個含有407個氨基酸的受體蛋白。BLAST結(jié)果顯示,CgTAR1與來自蝗蟲Locusta migratoria的酪胺受體TAR1同源性最高。同源多序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,CgTAR1屬于無脊椎動物OA/TA受體家族中類α2-腎上腺素的酪胺受體亞家族。隨后,通過qPCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)以及整體免疫熒光定位技術(shù)研究了CgTAR1在長牡蠣不同發(fā)育時期和不同成體組織中的時空表達(dá)模式。結(jié)果顯示,CgTAR1 mRNA在長牡蠣桑椹胚期、囊胚期和眼點(diǎn)幼蟲期有較高的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平,而在D型幼蟲期和殼頂幼蟲期幾乎沒有或者只有少量的表達(dá)。在蛋白水平上,CgTAR1在長牡蠣從卵細(xì)胞發(fā)育到D型幼蟲期中均有大量的表達(dá),表明CgTAR1可能參與長牡蠣的胚胎發(fā)生、組織分化和器官形成過程,在長牡蠣的早中期發(fā)育過程中起著重要的作用。CgTAR1的免疫熒光信號首先出現(xiàn)在原腸胚期多個細(xì)胞的細(xì)胞膜上,然后出現(xiàn)在擔(dān)輪幼蟲期的腸上,在隨后的發(fā)育階段中,CgTAR1的免疫熒光信號主要出現(xiàn)在長牡蠣幼蟲的面盤、殼頂和鰓等處,這表明CgTAR1在長牡蠣幼蟲感應(yīng)外界環(huán)境等生理過程中可能也扮演著一定的角色。在長牡蠣的所有成體檢測組織中,均檢測到CgTAR1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。其中,CgTAR1在性腺中的轉(zhuǎn)錄水平最高,在消化腺中的轉(zhuǎn)錄水平最低,這表明CgTAR1可能在長牡蠣的成體組織中也發(fā)揮著一定的作用。我們對CgTAR1的研究為后續(xù)進(jìn)一步地研究CgTAR1及其近源蛋白在海洋貝類中的生理功能奠定了良好的基礎(chǔ)。
【圖文】：

G 蛋白偶聯(lián)受體研究進(jìn)展.1 G 蛋白偶聯(lián)受體概述G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）是膜蛋白受體家族一大類群，也是細(xì)胞表面受體家族中成員最多的一類受體。在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)程中，GPCR 由于能夠結(jié)合到細(xì)胞膜表面的 G 蛋白（guanine nucleotide-bindotein）上并激活 G 蛋白以及下游的效應(yīng)器，所以被稱為 G 蛋白偶聯(lián)受體。能夠結(jié)合G蛋白，這類受體在序列和結(jié)構(gòu)通常表現(xiàn)出一些共有的特征（圖1-體結(jié)構(gòu)中都有 7 個疏水的跨膜 α 螺旋，所以 GPCR 也被稱為 7 次跨膜受7-transmembrane receptor，7-TM receptor）(Trzaskowski et al., 2012)；GPCR肽鏈的 C 端以及連接第 5 個和第 6 個跨膜 α 螺旋的胞內(nèi)環(huán)上都有 G 蛋白的位點(diǎn)。

圖1-2 G蛋白偶聯(lián)受體的家族分類情況。Figure 1-2 The family classification of G protein coupled receptors (Huang et al., 2004).在這 6 個 GPCR 家族中，A 類受體家族是研究得最為廣泛和成員數(shù)量最多的GPCR 家族，，其受體的數(shù)量約占據(jù)了目前已發(fā)現(xiàn)的 GPCR 總數(shù)的 85%。因此，鑒于其龐大的成員數(shù)量，A 類受體家族又被進(jìn)一步細(xì)分為了 19 個亞家族（圖 1-2），包括了生物胺類受體亞家族（Biogenic amine receptor subfamily）、視紫紅質(zhì)類受體亞家族（Rhodopsin receptor subfamily）、大麻素受體亞家族（Cannabinoidreceptor subfamily）、CAPA 類受體亞家族（CAPA receptor subfamily）、蛻皮激素受體亞家族（Ecdysis triggering hormone receptor subfamily）、促性腺激素釋放激素受體亞家族（Gonadotropin-releasing hormone receptor subfamily）、促卵泡激素受體亞家族（Follicle-stimulating hormone receptor subfamily）、羥基羧酸受體亞家族（Hydroxycarboxylic acid receptor subfamily）、白細(xì)胞三烯素 B4 受體亞家族
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 楊梅;許飛;劉俊;李莉;張國范;;長牡蠣(Crassostrea gigas)Wnt4基因cDNA克隆與表達(dá)分析[J];海洋與湖沼;2015年01期

2 柯才煥，李少菁，李復(fù)雪，鄭重;兒茶酚胺對翡翠貽貝幼體附著和變態(tài)的誘導(dǎo)[J];廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1995年06期

本文編號：2628376