【摘要】：本研究采集了17個地理種群163尾個體的沙塘鱧屬(Odontobutis)魚類,依次為中華沙塘鱧5個種群:宜都種群(Yi Dou population,簡稱“YD”)8尾、宜昌當陽種群(Dang Yang population,簡稱“DY”)10尾、荊州種群(Jing Zhou population,簡稱“JZ”)10尾、岳陽洪湖種群(Hong Hu population,簡稱“HH”)6尾和鷹潭種群(Yingtan population,簡稱“YT”)10尾;河川沙塘鱧12個種群分別為:六安種群(Lu An population,簡稱“LA”)10尾、巢湖種群(Chao Hu population,簡稱“CH”)10尾、宣城種群(Xuan Cheng population,簡稱“XC”)10尾、黃山種群(Huang Shang population,簡稱“HS”)9尾、淮安種群(Huai An population,簡稱“HA”)10尾、揚州種群(Yang Zhou population,簡稱“YZ”)10尾、高郵種群(Gao You population,簡稱“GY”)10尾、靖江種群(Jing Jiang population,簡稱“JJ”)10尾、湖州九里橋種群(Hu Zhou Jiuliqiao population,簡稱“HZJ”)10尾、湖州太湖種群(Hu Zhou Taihu population,簡稱“HZT”)10尾、蘇州種群(Su Zhou population,簡稱“SZ”)10尾和上海種群(Shang Hai population,簡稱“SH”)10尾。通過線粒體分子標記(線粒體全長與D-loop區(qū))和核基因標記(3個EPICs標記與微衛(wèi)星標記)的擴增,分析了我國長江流域及淮河流域沙塘鱧屬魚類的種群遺傳多樣性與遺傳結構,并探討了這種遺傳多樣性差異性分布的空間格局成因以及與地理環(huán)境之間的關系。主要結果如下:1.長江流域沙塘鱧屬魚類線粒體基因組重排與分子標記篩選采用引物步移法PCR擴增,獲得全長為16846bp的河川沙塘鱧(Odontobutis potamophila)線粒體全基因組(mt DNA),并對其基因結構、重排機制及在系統(tǒng)發(fā)育中的應用進行了分析。主要結果為:(1)河川沙塘鱧mt DNA由37個基因和一個非編碼控制區(qū)組成;除ND6和8個t RNAs外,其他基因都編碼在重鏈(H)上;t RNA基因因發(fā)生滑移重排(shuffling),將經(jīng)典的線粒體基因組HSL(t RNAHis-t RNAser-t RNALeu)排序變成了SLH(t RNAser-t RNALeu-t RNAHis)排列,造成在t RNALeu與t RNAHis、ND4與t RNASer之間分別插入了320bp和42bp的兩個“匿名區(qū)”。(2)檢測的112種鱸形目(Perciformes)魚類中,僅有13種(11.61%)發(fā)生了mt DNA基因重排現(xiàn)象,而沙塘鱧屬的中華沙塘鱧(O.sinensis)、平頭沙塘鱧(O.platycephala)與河川沙塘鱧的基因重排位置一致,揭示其可能是沙塘鱧屬魚類進化過程中的一個重要分子“標簽”。(3)ND4和ND5為兩個可用于蝦虎魚亞目(Gobioidei)魚類科階元水平的系統(tǒng)發(fā)育關系重建的合適分子標記。2.基于線粒體控制區(qū)的長江流域及淮河流域沙塘鱧屬魚類種群遺傳多樣性與種群遺傳結構分析從YD、DY、JZ、HH和YT等5個中華沙塘鱧種群,采集44尾個體;從LA、CH、XC、HS、HA、YZ、GY、JJ、HZJ、HZT、SZ和SH等12個河川沙塘鱧種群,采集119尾個體,擴增線粒體控制區(qū)(D-loop)1041bp,分析時去除兩端測序錯誤和比對缺失區(qū)(missing data)后,選取906bp序列用于遺傳學分析,結果如下:(1)遺傳多樣性分析。中華沙塘鱧有73個變異或多態(tài)位點(8.06%),44條堿基序列可定義22個單倍型,其中H6為共享單倍型(34.09%);河川沙塘鱧有21個變異或多態(tài)位點(2.32%),119條堿基序列可定義12個單倍型,共享單倍型為H11(63.86%)、H16(3.36%)與H18(10.08%),河川沙塘鱧單倍型較為貧乏。(2)種群遺傳多樣性分析。中華沙塘鱧種群的平均單倍型多樣性(Hd)與核苷酸多樣性(π)依次為0.7197和0.0057;而河川沙塘鱧的為0.1796和0.0007。其中YT、DY與CH等種群的Hd和π較高,其他種群的較低,尤其是HS與LA等種群的最低。以上結果顯示出,依賴于線粒體控制區(qū),長江流域及淮河流域分布的沙塘鱧屬魚類遺傳多樣性較低,且中華沙塘鱧的遺傳多樣性較河川沙塘鱧的高。(3)遺傳分化與種群遺傳結構分析。中華沙塘鱧與河川沙塘鱧的種群間遺傳分化指數(shù)(FST)依次為0.4822與0.9023,處于較高水平遺傳差異(FST0.25);AMOVA分析結果顯示兩物種具有顯著的遺傳結構;種群間NJ分子系統(tǒng)發(fā)育關系揭示:17個沙塘鱧種群顯著的分為兩大支,即中華沙塘鱧的5個種群(YT、YD、HH、DY、JZ)22個單倍型聚為一支(Cluster 1),河川沙塘鱧的12個種群12個單倍型序列聚為另一大支,而且也可以看出河川沙塘鱧12個種群可以細分為兩個大的聚類支,分別為分布于長江中游的LA、CH、XC和HS 4種群聚為一支(Cluster 3),分布于長江下游及淮河下游的8個種群4個單倍型序列聚為一支(Cluster 2),且3個聚類分支呈現(xiàn)出按不同地理區(qū)域分別聚類的現(xiàn)象,單倍型最小跨度網(wǎng)絡關系圖結果與其一致。(4)種群歷史動態(tài)。中性檢測和錯配分析均揭示,中華沙塘鱧種群都曾發(fā)生過種群擴張事件;河川沙塘鱧種群除GY、SZ、HZT和CH等4種群外都沒有發(fā)生過種群擴張事件。按聚類關系來看,Cluster1與Cluster 2聚類群經(jīng)歷了歷史種群擴張事件,Cluster3未發(fā)生過種群擴張事件。若以線粒體D-loop基因每百萬年3%~12%的進化速率,估計得到的中華沙塘鱧與河川沙塘鱧種群擴張時間分別為0.0237~0.0946Myr與0.0048~0.0193Myr前,均約為第四紀更新世晚期。中華沙塘鱧的分化時間較早。3基于核基因EPICs分子標記的沙塘鱧屬魚類的種群遺傳多樣性及分子生物地理學研究EPICs(Exon-primed intron-crossing markers),是一種匿名核基因標記的研究,原理是在匿名外顯子區(qū)設計引物對中間內(nèi)含子進行擴增,使得該標記既具有外顯子的保守特性,又具有內(nèi)含子進化速率快的特點。EPICs內(nèi)含子標記因外顯子較內(nèi)含子更保守并且有大量匿名基因,已成功的運用于物種水平和更廣泛的生物分類單元研究中。本實驗克隆選取55378E1、55305E1和36298E1全序列,分別長1300bp、1600bp與2100bp,分析時去除兩端測序錯誤和比對缺失區(qū)(missing data),并進行顯著性PHI檢測去除重組序列52bp,然后拼接為3733bp進一步對上述17個沙塘鱧屬魚類種群進行遺傳結構分析,結果如下:(1)序列分析。中華沙塘鱧種群有279個多態(tài)位點(7.47%),44條堿基序列可定義44個單倍型(haplotypes);河川沙塘鱧有343個多態(tài)位點(9.19%),119條堿基序列可定義115個單倍型。(2)遺傳多樣性分析。中華沙塘鱧種群的單倍型多樣性(Hd)與核苷酸多樣性(π)為1.0000和0.0118,核苷酸多樣性變化范圍為0.0034~0.0121;而河川沙塘鱧的Hd與π為0.9994和0.0039,Hd與π變化范圍在0.9167~1.0000和0.0007~0.0037之間。顯示出不論是中華沙塘鱧還是河川沙塘鱧,都是單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低,且中華沙塘鱧遺傳多樣性高于河川沙塘鱧的遺傳多樣性。(3)種群NJ聚類分析。中華沙塘鱧5個種群間遺傳距離變化范圍為0.0086~0.0149;河川沙塘鱧12個種群間的遺傳距離變化范圍為0.0026~0.0067。NJ單倍型種群遺傳距離分子系統(tǒng)發(fā)育關系顯示:17個沙塘鱧種群顯著的分為兩大支,即中華沙塘鱧的5個種群44個單倍型聚為一支(Cluster 1),河川沙塘鱧的12個種群115個單倍型序列可以聚為另外一大支(Cluster 3),且2個大的聚類分支明顯呈現(xiàn)出按不同地理區(qū)域分別聚類的現(xiàn)象,即Cluster 1組群分布于長江中上游,Cluster 3組群分布于長江中下游開闊的沖積平原。另外也可以看出,Cluster 2組群是從Cluster 3組群中細分出來的,Cluster 2組群分布于淮河上游與長江中游的安徽巢湖、宣城以及黃山等地。Cluster 2與Cluster 3內(nèi)部個體單倍型基因序列也出現(xiàn)了較少的不同地理區(qū)域交叉聚類的現(xiàn)象。(4)種群遺傳結構分析。17個種群間FST均較高(0.7325~0.7709)。AMOVA顯示出17個種群被分為3組時遺傳分化指數(shù)最高,且種群間的變異(0.7709)大于種群內(nèi)個體間的變異(0.1992)(P0.01),說明沙塘鱧屬魚類種群的遺傳差異主要表現(xiàn)在種群間。單倍型最小跨度網(wǎng)絡關系顯示出:中華沙塘鱧與河川沙塘鱧經(jīng)過了117次的變異才區(qū)分開來。(5)中性檢驗分析與核苷酸錯配分布分析,Cluster 1、Cluster 2與Cluster 3的Tajima’s D依次為-1.2913(P0.05)、-2.0365(P0.05)和-2.6175(P0.01),Fu’s FS值依次為-17.0490(P0.05)、-23.1810(P0.01)與-92.8640(P0.01),Rg與R2全大于零(P0.05),這些都顯示出這三大聚類群經(jīng)歷了歷史種群擴張事件。(6)中華沙塘鱧與河川沙塘鱧的分界地理屏障可能是長江中游安徽境內(nèi)的皖南山區(qū)(大別山和黃山)�！熬嚯x-隔離”模型檢驗結果顯示,Cluster 2種群間的地理距離(直線距離)和遺傳距離[F’st/(1-F’st]的正相關性為Y(x)=0.0027*x+0.4104,分布斜率較小,Cluster 2種群間內(nèi)部遺傳距離較小,分布較集中;相較而言,Cluster 3種群間的地理距離和遺傳距離的正相關性為Y(x)=0.0071*x+0.9465,分布斜率較大,Cluster 3種群間內(nèi)部遺傳距離[F’st/(1-F’st]分布較廣泛。(7)沙塘鱧屬魚類的系統(tǒng)地理格局應該屬于Avise系統(tǒng)地理格局中的第三或第五種:即不同種群系統(tǒng)發(fā)育關系連續(xù),所屬地理分布不同或部分連續(xù),部分種群發(fā)生過種群替代現(xiàn)象,替代時間較短,尤其分布于長江中下游的河川沙塘鱧呈現(xiàn)出中度水平的基因交流,僅部分基因型具有廣泛的地理分布格局,即共享單倍型種類較少。4.基于微衛(wèi)星標記的沙塘鱧屬魚類種群遺傳多樣性與種群遺傳結構分析(1)利用生物素標記-磁珠富集法開發(fā)中華沙塘鱧與河川沙塘鱧的微衛(wèi)星分子標記,分別篩選出了13對和14對微衛(wèi)星引物,依次用湖北荊州種群(JZ)和江蘇蘇州太湖種群(SZ)27尾個體與45尾個體進行分子標記多態(tài)性檢測。結果為:中華沙塘鱧,等位基因數(shù)目NA、多態(tài)信息含量PIC、觀測雜合度HO和期望雜合度HE分別為6~21(平均14.2778)、0.7447~0.9303(平均0.8816)、0.3333~1.0000(平均0.5412)和0.7764~0.9518(平均0.8812)。有3個位點(O.sin7,O.sin13和O.sin 17)顯著偏離哈溫平衡(HWE)(*P0.05),經(jīng)Bonferroni矯正,13個微衛(wèi)星位點間未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡;河川沙塘鱧,等位基因數(shù)目NA、多態(tài)信息含量PIC、觀測雜合度HO和期望雜合度HE依次為8~30(平均20.9286)、0.8020~0.9354(平均0.8962)、0.7500~1.0000(平均0.9508)和0.8436~0.9628(平均0.9101),6個多態(tài)性微衛(wèi)星位點(O.pot1,O.pot2,O.pot4,O.pot5,O.pot10 and O.pot14)偏離哈溫平衡(*P0.05),經(jīng)Bonferroni矯正,14個微衛(wèi)星位點間未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡。本研究開發(fā)的兩種魚27對SSR引物的PIC值均較高,這對于進一步研究沙塘鱧屬魚類的遺傳多樣性與種群遺傳結構意義重大,因為,更高的PIC值(PIC0.5)相對而言能夠提供更加豐富的遺傳信息。(2)對篩選的27對引物進行跨種擴增(Cross-species amplification),得到可以同時穩(wěn)定擴增兩種沙塘鱧的適用性引物10對。應用于長江流域和淮河流域沙塘鱧屬魚類種群的遺傳多樣性與遺傳結構分析。結果為:①遺傳多樣性分析,其中中華沙塘鱧與河川沙塘鱧平均等位基因數(shù)NA、平均等位基因豐富度AR、平均期望雜合度和觀測雜合度(HE和HO)、平均多態(tài)信息含量PIC依次為10.6000與10.8333、8.2728與8.0890、0.9678與0.9600、0.9240與0.9143、0.8559與0.8546。各種群之間近交系數(shù)FIS變化范圍為-0.0820~0.0690,平均近交系數(shù)為-0.0595,顯示沙塘鱧種群偏向于隨機交配。以上各指標均表明,長江流域沙塘鱧屬魚類野生種群的遺傳多樣性較豐富,且中華沙塘鱧種群的遺傳多樣性較河川沙塘鱧的稍高。②種群的遺傳結構和聚類分析,對于中華沙塘鱧和河川沙塘鱧而言,不同種群間的遺傳距離變化范圍分別為-0.0179~0.0413和0.0038~0.0943。AMOVA分析顯示:組群間的遺傳差異最小,組群內(nèi)種群間的遺傳差異最大。STRUCTURE聚類分析發(fā)現(xiàn),長江流域及淮河流域的沙塘鱧屬魚類種群最佳分群為3組,Cluster 1為YD種群、DY種群、JZ種群、HH種群與YT種群;Cluster 2為LA種群、CH種群、XC種群與HS種群;Cluster 3為HA種群、YZ種群、GY種群、JJ種群、SZ種群、HZJ種群、HZT種群與SH種群。主坐標分析(Principal coordinates analysis,PCo A)結果也支持這種分類,同時也可以看出,LA種群和HS種群分布最遠,揭示出這兩種群相對于其他種群而言分化程度較大。③種群的歷史動態(tài)分析,BOTTLENECK瓶頸效應分析顯示,長江流域及淮河流域沙塘鱧屬魚類中華沙塘鱧5個種群均沒有經(jīng)歷過瓶頸效應,而河川沙塘鱧中有4個種群可能經(jīng)歷過不連續(xù)的瓶頸效應。
【圖文】：

長江流域簡圖(引自傅萃長[4]

上海海洋大學碩士學位論文數(shù)較大，為 44~53；然而，河川沙塘鱧和海豐沙塘鱧眼后頭頂常規(guī)排布方式；另外，，河川沙塘鱧一般縱列鱗數(shù)目為 34~41，線端部為直線乳突線排列方式，而海豐沙塘鱧的縱列鱗數(shù)目下橫行感覺乳突線端部為團狀或分叉乳突線排列方式[13, 14]。這別，結合樣本分布范圍，可以較容易地對沙塘鱧屬魚類進行形）。通過對淮河流域分布的沙塘鱧頭部的形態(tài)特征以及其它可數(shù)可德亮&洪磊(2007)[15]發(fā)現(xiàn)它們頭部眼后方無感覺管孔 C，但又數(shù)性狀上不同。建議淮河流域的沙塘鱧仍沿用暗色沙塘鱧utis obscura），因而分類學地位有待進一步確認。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2621939