【摘要】：針對(duì)近年來海南養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)常暴發(fā)早期死亡綜合癥、白便綜合癥、發(fā)光病等重大流行性疾病,同時(shí)其機(jī)體內(nèi)常攜帶大量弧菌的現(xiàn)象,本文選擇海南臨高新盈、�？跇s山、萬寧山根、東方四更和新龍、昌江昌化的重要代表性凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)的患病對(duì)蝦,從48個(gè)病蝦樣品中共分離獲得514株弧菌；采用3種弧菌的特異性PCR檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明,哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)91株,溶藻弧菌(V. alginolyticus)24株,副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)0株,其它弧菌399株；按照5%的比例隨機(jī)抽取上述鑒定菌株開展16S rDNA序列分析和標(biāo)準(zhǔn)生理生化鑒定,結(jié)果與特異性PCR檢測(cè)方法結(jié)果一致。因此,除了哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌外,海南地區(qū)養(yǎng)殖對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)還存在多種其它弧菌。在良好水質(zhì)環(huán)境中開展投喂和浸泡方式的回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明,僅從東方分離的哈維氏弧菌PBVH3311具有明顯的致病性,可產(chǎn)生與自然患病對(duì)蝦相似的癥狀。因此,我們推測(cè)：海南地區(qū)的對(duì)蝦弧菌病原絕大多數(shù)應(yīng)該為嚴(yán)格依賴環(huán)境條件的條件致病性菌株,可通過改善養(yǎng)殖環(huán)境防止這些疾病的暴發(fā)。以腸桿菌基因間重復(fù)共有序列PCR (ERIC-PCR)技術(shù)對(duì)上述哈維氏弧菌和溶藻弧菌開展了分子血清型研究,結(jié)果表明：(1)對(duì)哈維氏弧菌而言,在45%的相似度時(shí),91株哈維氏弧菌聚為1類群；在80%的相似度時(shí),這些菌株分為14個(gè)類群(分子血清型),其中來自東方四更和新龍的發(fā)光病對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)的36株哈維氏弧菌屬同一個(gè)類群,而其他地區(qū)來源的菌株無明顯的地域集中分布特征。(2)對(duì)溶藻弧菌而言,在45%的相似度時(shí),24個(gè)菌株也完全聚為1類群；在80%的相似度時(shí),這些溶藻弧菌分為15個(gè)類群,且無明顯的地域集中特征�？傊�,除了從發(fā)光病對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)分離的哈維氏弧菌外,從其它患病對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)的分離的哈維氏弧菌和溶藻弧菌的遺傳多樣性都較高,未出現(xiàn)某一分子血清型集中分布的現(xiàn)象。因此,多種分子血清型哈維氏弧菌和溶藻弧菌存在于海南的患病養(yǎng)殖對(duì)蝦機(jī)體內(nèi),這些菌株為潛在的細(xì)菌病原(原發(fā)或繼發(fā)),所以,這兩種細(xì)菌病的防治難度較大,對(duì)海南養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦存在嚴(yán)重潛在威脅。采用瓊脂擴(kuò)散法及雙層平板法,篩選PBVH3311的拮抗菌,結(jié)果表明WCPW15003、WCPW15004、HKPW15005這3株菌遺傳穩(wěn)定性高且均對(duì)PBVH3311有明顯的拮抗效果,平均抑菌圈直徑大小分別為16.93mm、23.54mm、 22.86mm。經(jīng)16S rDNA序列分析和標(biāo)準(zhǔn)生理生化鑒定,這3株菌均被確定為殺魚假交替單胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)。毒力基因篩查結(jié)果表明,WCPW15003、WCPW15004、HKPW15005均無exoT、exoU、exoS、exoY、phzH、 phzM、phzⅠ、phzⅡ、apr、lasA、lasB、pilB等假交替單胞菌屬的常見毒力基因；安全性養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)水體中拮抗菌菌液濃度為1.7×108 CFU/mL時(shí),凡納濱對(duì)蝦[體重為(2.0±0.5)g/尾]仍未出現(xiàn)死亡及其他異�，F(xiàn)象。同時(shí),測(cè)定了這3株拮抗菌在不同溫度(4℃、20℃、30℃、40℃)、鹽度(0‰、25‰、50‰、75‰、100‰、125‰、150‰)、酸堿度(pH 3、5、7、9、11)的生長(zhǎng)特性,結(jié)果表明,WCPW15003、WCPW15004、HKPW15005在溫度為20℃-40℃、pH為5-9范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好,WCPW15003、WCPW15004在鹽度為0-50%o、 HKPW15005在鹽度為0-100‰范圍內(nèi)生長(zhǎng)較好。進(jìn)一步采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)3株拮抗菌的廣譜抗菌性作了深入研究,結(jié)果表明,WCPW15003、WCPW15004、 HKPW15005對(duì)本文分離的91株哈維氏弧菌混合樣品和24株溶藻弧菌的混合樣品都有顯著的拮抗效果,抑菌圈直徑都大于5mm；對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的10株其它哈維氏弧菌、2株溶藻弧菌和1株副溶血弧菌也有顯著的拮抗效果,抑菌圈直徑大于5mm。最后,以市售的高效拮抗菌產(chǎn)品為陽性對(duì)照,測(cè)定了這3株拮抗菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中弧菌(終濃度2.1×107CFU/mL)的拮抗效果。結(jié)果表明,WCPW15003在96h時(shí)對(duì)弧菌的拮抗效果效果最為顯著,5個(gè)不同濃度拮抗菌試驗(yàn)組(107 CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL)弧菌數(shù)量分別為4.6×106CFU/mL、1.08×107CFU/mL、1.05×107CFU/mL、1.5×107 CFU/mL、1.7×107CFU/mL,減少了78.1%、48.6%、50.0%、38.6%、19.0%；HKPW15005在96h時(shí)拮抗效果效果最為顯著,各試驗(yàn)組(107CFU/mL、106 CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL)弧菌數(shù)量分別為4.9×105 CFU/mL、1.06×106 CFU/mL、4.9×106 CFU/mL、3.2×106 CFU/mL、4.8×106 CFU/mL,減少了97.7%、94.9%、76.7%、84.8%、77.1%; WCPW15004(終濃度103 CFU/mL)在120h時(shí)拮抗效果效果最為顯著,弧菌數(shù)量為1.79×107CFU/mL,減少了14.8%。這3株拮抗菌為今后建立基于有益微生物制劑的海南凡納濱對(duì)蝦弧菌病的安全防控技術(shù)奠定了重要基礎(chǔ)。
【圖文】：

（２０１４年７月）；海口榮山市某養(yǎng)殖場(chǎng)的患病對(duì)幰癥狀為吃料銳減，腸炎嚴(yán)重，逡逑生長(zhǎng)緩慢，腸炎嚴(yán)重，體表有白斑，伴有白便，死亡率達(dá)到＾％１＾上（２0１４年８逡逑月）（圖１）；萬寧山根某養(yǎng)殖場(chǎng)的患病對(duì)奸癥狀為吃料銳減，空腸道，有伴白便，逡逑死亡率達(dá)到７０％Ｗ上（２０１４年８月）；昌江昌化某養(yǎng)殖場(chǎng)的患病對(duì)臥癥狀為臥體逡逑呈面條狀軟綿，肌肉白灼，巧萎縮，空腸道，有伴白便，，死亡率高達(dá)８５％Ｗ上（２０１４逡逑年１０月）。逡逑興嚴(yán)：百堿苗．叩’．ｉｆｆｌ逡逑圖１白便綜合癥患病對(duì)巧及白便逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｄｉｓｅａｓｅｄ邋ｓｈｒｉｍｐ邋ｗｉｔｈ邋ｗｈｉｔｅ邋ｆｅｃｅｓ邋ｓｙｎｄｒｏｍｅ逡逑３．１．邋２病原菌的分離逡逑在２０１３￣２０１５年間，從５個(gè)養(yǎng)殖區(qū)共采集４８份患病對(duì)臥樣品。其中，４５份逡逑樣品的肝族腺部位和１８份樣品的肌肉部位均分離獲得了大量弧菌，且同一幰體逡逑的肝族腺、肌肉部位分離的細(xì)菌在ＴＣＢＳ培養(yǎng)基上形成的菌落顏色與形態(tài)基本一逡逑致。其中，臨高新盈養(yǎng)殖場(chǎng)病砰樣品肝膀腺、肌肉部位的菌含量分別為（４．０邋＋逡逑０．８）邋ｘｉ0６ＣＦＵ／ｇ、（５．２＋１．２）邋ｘｌ0５ＣＦＵ／ｇ；東方四更和新龍四更和新龍養(yǎng)殖場(chǎng)病逡逑臥樣品肝族腺部位的菌含量為（８．１±０．４）ｘｌ0５ＣＦＵ／ｇ，肌肉部位沒有分離到弧菌；逡逑海日榮山養(yǎng)殖區(qū)的病郵樣品巧族腺和肌肉部位均沒分離到弧菌：萬寧山根養(yǎng)殖場(chǎng)逡逑病蟲下樣品肝膜腺、肌肉部位的菌含量分別為（２．０６＋１．６）邋ｘｌ0６ＣＦＵ／ｇ、（８．３邋＋邋０．５）逡逑ｘｌＯNBＦＵ／ｇ；昌江昌化養(yǎng)殖場(chǎng)病邱樣品肝膜腺部位菌含量為（４．１±２．３）ｘＩ0４ＣＦＵ／ｇ

邐海南大學(xué)碩壬學(xué)位論文邐逡逑肌肉部位沒有分離到弧菌。ＴＣＢＳ培養(yǎng)基涂布后，３０邋‘Ｃ培養(yǎng)２０邋ｈ出現(xiàn)直徑為１￣３逡逑ｍｍ、圓形光滑、粘稠的菌落，其中，多數(shù)為黃色菌落，少數(shù)為綠色菌落。從所逡逑有樣本中，共分離得到５１４株弧菌。逡逑３．邋２病師體內(nèi)菌種的鑒定逡逑３．邋２．邋１邋ＰＣＲ快速檢測(cè)逡逑采用哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的特異性引物對(duì)分離的弧菌進(jìn)行快逡逑速檢測(cè)，結(jié)果表明，５】４株弧菌中哈維氏弧菌９１邋（表８）、溶藻弧菌２４株（表９）、逡逑副溶血弧茜０株。其中，哈維氏弧菌（３６３ｂｐ）分別為分離自臨高新盈（ｎ＝９）的逡逑９個(gè)白便綜合癥樣品、東方四更和新龍（ｎ＝４０）邋（３６株分離自發(fā)光病的９個(gè)樣品）逡逑的１２個(gè)白便綜合癥和發(fā)光病的樣品、萬寧山根（ｎ＝３０）的９個(gè)白便綜合癥樣品、逡逑昌江昌化（ｎ＝Ｉ２）的９個(gè)偷死病的樣品（圖２）。溶藻孤菌（２５３ｂｐ）分別為分離逡逑自東方四更和新龍（ｎ＝１０）的１２個(gè)白便綜合癥和發(fā)光病樣品、萬寧山根（ｎ＝５）逡逑的９個(gè)白便綜合癥樣品、昌江昌化（ｎ＝９）的９個(gè)偷死病樣品（圖３）。逡逑
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S945.49

【參考文獻(xiàn)】

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1 龔斌;潘育勝;張艷秋;方懷義;彭春艷;;凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌性病原的分離鑒定和耐藥性研究[J];微生物學(xué)雜志;2014年05期

2 黃興宇;;關(guān)于南美白對(duì)蝦“白便”的分析[J];當(dāng)代水產(chǎn);2014年09期

3 陳健舜;朱凝瑜;孔蕾;丁雪燕;鄭天倫;杜建明;;凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌性紅體病病原的分子特征與耐藥性[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2012年12期

4 唐紹林;雷燕;戚瑞榮;;南美白對(duì)蝦產(chǎn)生“白便”的原因及防治[J];科學(xué)養(yǎng)魚;2012年11期

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6 王樹杉;于敏;張曉華;;海洋細(xì)菌素的研究進(jìn)展[J];海洋科學(xué);2012年01期

7 袁豐華;林黑著;李卓佳;陸鑫;楊其彬;;地衣芽孢桿菌對(duì)尖吻鱸血液生理生化指標(biāo)的影響[J];南方水產(chǎn);2009年02期

8 儲(chǔ)衛(wèi)華;朱衛(wèi);康春濤;;海洋蛭弧菌的分離鑒定及其對(duì)副溶血弧菌的作用[J];微生物學(xué)通報(bào);2009年01期

9 王國(guó)良;祝t熈

本文編號(hào)：2621214