【摘要】：我國(guó)是貝類產(chǎn)品養(yǎng)殖、生產(chǎn)大國(guó),2014年牡蠣養(yǎng)殖面積已達(dá)12萬公頃,總產(chǎn)量超過380萬噸,已經(jīng)占全球牡蠣總產(chǎn)量的80.37%。太平洋牡蠣(Ostrea gigas)、近江牡蠣(Ostrea rivularis)、大連灣牡蠣(Ostrea talien whanensis)、褶牡蠣(Ostrea plicatula)為我國(guó)主要牡蠣養(yǎng)殖品種。近年來,隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,大量污染物質(zhì)被排放到海洋生態(tài)系統(tǒng)中,導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象嚴(yán)重,有害赤潮現(xiàn)象頻發(fā),有毒有害藻類的繁殖所產(chǎn)生的毒素可在貝類體內(nèi)富集,通過食物鏈傳遞,不僅直接危害消費(fèi)者身體健康,也會(huì)對(duì)水產(chǎn)品養(yǎng)殖加工帶來損失。目前,我國(guó)在貝類毒素的檢測(cè)和控制技術(shù)方面的研究存在一定局限性,缺少對(duì)海洋環(huán)境和生物體內(nèi)貝類毒素消長(zhǎng)變化的系統(tǒng)研究,也未能形成一套行之有效的貝類毒素污染預(yù)警與控制技術(shù)。本研究針對(duì)養(yǎng)殖區(qū)中牡蠣和海水環(huán)境,利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)分別建立了檢測(cè)五種腹瀉性貝類毒素(OA、DTX-1、DTX-2、GYM、PTX-2)和六種麻痹性貝類毒素(STX、dcSTX、GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4)的方法;根據(jù)固相毒素跟蹤技術(shù)(Solid Phase Adsorbent and Toxin Tracking,SPATT)原理,利用HP20大孔型吸附樹脂、SP700型樹脂分別建立了富集海水中腹瀉性與麻痹性貝類毒素的方法;基于已建立的毒素檢測(cè)和富集方法,采集養(yǎng)殖區(qū)中牡蠣與海水樣品,同步監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖海域內(nèi)牡蠣與海水中毒素含量,探究?jī)烧咧g的關(guān)系,建立牡蠣內(nèi)貝類毒素含量隨海水內(nèi)貝類毒素含量之間的變化規(guī)律,具體研究?jī)?nèi)容和主要結(jié)論如下:1.優(yōu)化了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牡蠣內(nèi)腹瀉性貝類毒素的方法并建立了海水中腹瀉性貝類毒素的富集與檢測(cè)方法。牡蠣組織中五種腹瀉性貝類毒素經(jīng)80%甲醇水提取,MAX陰離子固相萃取柱凈化,MGII C18分離色譜柱分離,選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下正負(fù)電噴霧離子源交替掃描。結(jié)果表明,常見的五種腹瀉性貝類毒素OA、DTX-1、DTX-2在負(fù)源下響應(yīng)較高,GYM、PTX-2在正源下響應(yīng)靈敏度高,線性范圍良好,R≥0.99,加標(biāo)回收率均在83.7~103.2%(n=6)之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)介于3.8~9.2%,OA、DTX-1、DTX-2、GYM、PTX-2的定量限為分別為1.5μg/kg,0.7μg/kg,1.2μg/kg,2.1μg/kg,0.6μg/kg。腹瀉性貝類毒素利用hp20大孔型吸附樹脂進(jìn)行富集,樹脂袋放置于海水中一周后取出,樹脂經(jīng)甲醇洗脫,二氯甲烷凈化后,檢測(cè)其中五種腹瀉性貝類毒素的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,hp20對(duì)五種腹瀉性貝類毒素有很強(qiáng)吸附能力,吸附回收率均在62.8~101.3%之間,五種腹瀉性貝類毒素oa、dtx-1、dtx-2、gym、ptx-2的定量限分別為5.2μg/20gresin*week,6.1μg/20gresin*week,4.5μg/20gresin*week,8.3μg/20gresin*week,7.4μg/20gresin*week。2.同步采集牡蠣與海水樣品,檢測(cè)腹瀉性毒素含量,監(jiān)測(cè)其變化特征并研究?jī)烧咧g的變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,五種腹瀉性貝類毒素中,除dtx-2在海水和牡蠣中都未能檢測(cè)到之外,其余四種均有檢出。海水中毒素含量的變化隨溫度的變化較為明顯,隨環(huán)境溫度的升高,海水中毒素含量升高,峰值集中出現(xiàn)在8月份,而后呈下降趨勢(shì);但臺(tái)風(fēng)等劇烈環(huán)境變化后,海水中腹瀉性貝類毒素含量有劇烈增高現(xiàn)象;在空間分布上,采樣表層海水中毒素含量均值大于中層含量大于下層含量,在每年8-9月份,該現(xiàn)象最顯著。牡蠣體內(nèi)四種腹瀉性貝類毒素含量均較低,其變化規(guī)律與海水中毒素含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系,即海水中毒素含量增高時(shí),牡蠣內(nèi)毒素含量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì),牡蠣中毒素含量達(dá)到峰值時(shí)間比海水中毒素含量達(dá)到峰值時(shí)間延后一到兩個(gè)采樣周期(一個(gè)采樣周期為7天),隨著海水環(huán)境中毒素含量的下降,牡蠣內(nèi)毒素含量也開始下降,但其下降趨勢(shì)較海水中緩慢。3.建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牡蠣內(nèi)麻痹性貝類毒素的方法和海水中麻痹性貝類毒素的富集與檢測(cè)技術(shù)。牡蠣組織中麻痹性貝毒由1‰甲酸水溶液提取,凈化后經(jīng)amide-80色譜分析,乙腈與水溶液(含1‰甲酸和2mm甲酸銨)作為流動(dòng)相梯度洗脫,電噴霧離子源正離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式質(zhì)譜掃描。結(jié)果顯示,常見的六種麻痹性貝類毒素響應(yīng)靈敏度高,線性范圍良好,r≥0.99,毒素stx,dcstx,gtx-1、4,gtx-2,gtx-3的定量限分別為7.6μg/kg,17.3μg/kg,35.5μg/kg,25.8μg/kg,21.5μg/kg。在牡蠣空白樣品中添加六種麻痹性貝類毒素高中低三個(gè)不同濃度水平混標(biāo),其回收率均在63.7~79.1%(n=6),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為7.2~12.6%。利用sp700樹脂富集海水中麻痹性貝類毒素,毒素經(jīng)1‰甲酸水溶液提取后,hlb固相萃取小柱凈化,用已建立的檢測(cè)方法測(cè)定含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,樹脂在一個(gè)采樣周期內(nèi)六種常見的麻痹性貝毒吸附回收率在60.9%~81.5%,毒素stx,dcstx,gtx-1、4,gtx-2,gtx-3在樹脂中的定量限分別為10μg/20gresin*week,20μg/20gresin*week,45μg/20gresin*week,30μg/20gresin*week,25μg/20gresin*week,滿足實(shí)驗(yàn)要求。4.同步采集牡蠣與海水樣品,監(jiān)測(cè)其中麻痹性毒素含量,探究其變化特征并研究?jī)烧咧g的變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示麻痹性貝毒STX、dcSTX在監(jiān)控海域內(nèi)有檢出,其他毒素未檢出,在時(shí)間分布上,其峰值出現(xiàn)在8月下旬,隨時(shí)間變化規(guī)律上同腹瀉性貝類毒素類似,也是呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)。在牡蠣中,可檢測(cè)到STX存在,其含量隨海水中毒素含量變化呈現(xiàn)正相關(guān)性,峰值出現(xiàn)的時(shí)間差為2個(gè)采樣周期,且降解速度緩慢,其他五種麻痹性貝類毒素在采樣海域養(yǎng)殖牡蠣中未檢出。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文18圖2-2 牡蠣肌肉組織中五種毒素加標(biāo)色譜圖Fig.2-2 Chromatograms of spiked scallop muscle2.1.3.5方法回收率與精密度方法的檢出限與定量限分別是通過儀器上的三倍信噪比與十倍信噪比來確定的，但實(shí)際操作過程中，很難達(dá)到如此低的檢出限與定量限。方法的檢出限指的是在現(xiàn)有儀器與檢測(cè)條件下，能檢測(cè)到該目標(biāo)物質(zhì)存在的最低濃度，定量限是指在現(xiàn)有的檢測(cè)條件下，能準(zhǔn)確定量該目標(biāo)物質(zhì)的最低濃度，，定量限要求能有較好的回收，并且能有一定的平行性與穩(wěn)定性。根據(jù)儀器軟件計(jì)算，以三倍信噪比，并計(jì)入試樣量與最終體積后，得到五種腹瀉性貝類毒素 OA、DTX-1、DTX-2、GYM、PTX-2 在牡蠣中的檢出限為 0.4μg/kg，0.2μg/kg，0.3μg/kg

裝入 10g DIAION HP20 大孔吸附樹脂固定尼掛扣。把吸附袋在甲醇中浸泡 24h，然后餾水重復(fù) 3 次，放入密封的塑料袋中，在 4℃條件下含五種貝類毒素的海水，分別放置于 5 個(gè)相同的水，并加入濃度為500μg/L的含有四種毒素的混合標(biāo)脂吸附袋，進(jìn)行主動(dòng)吸附，分別在第 1、3、5、 3 組平行，取平均值。毒素富集方法內(nèi)根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，分別在整個(gè)養(yǎng)殖區(qū)的四個(gè)角采樣點(diǎn)，與牡蠣采樣點(diǎn)為同一采樣點(diǎn)，采樣周期為，分上、中、下三層，層間隔 2 米，每層一次固定的漂浮桿上，每間隔 7 天將吸附袋取出，再放入餾水沖洗，放入預(yù)先編號(hào)的樣品袋中，冰盒保存。采樣示意圖如下。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X836;S912

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本文編號(hào)：2619259