大豆(Glycine max)是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物,是人類重要的植物蛋白和油分的來(lái)源,在食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要地位。大豆作為豆科作物,可通過(guò)結(jié)瘤進(jìn)行生物固氮。高效利用共生固氮對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要,有助于提高大豆的生產(chǎn)力和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。但大豆自身古四倍體基因組的冗余性,使得大豆結(jié)瘤固氮調(diào)控基因的挖掘工作相對(duì)滯后。本研究通過(guò)同源性和表達(dá)譜的分析,篩選到18個(gè)可能參與大豆結(jié)瘤調(diào)控途徑的基因,借助高通量CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除。共設(shè)計(jì)20個(gè)sg RNA靶向18個(gè)目的基因,經(jīng)過(guò)4次大豆的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化得到覆蓋所有20個(gè)sg RNA載體在內(nèi)的120棵陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。T₀代以sg RNA統(tǒng)計(jì)群體的編輯效率,其平均編輯效率為32.7%。以目的基因統(tǒng)計(jì)整體基因編輯效率為45.8%。20個(gè)株系中,T₁代有8個(gè)株系發(fā)生基因編輯,而在T₀代僅有6個(gè)株系。T₁代基因編輯效率在T₀代基礎(chǔ)上有所提高。從構(gòu)建的“高效結(jié)瘤”突變體庫(kù)中我們篩選到與結(jié)瘤自調(diào)控途徑相關(guān)的“高效結(jié)瘤...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 前言
    1.1 引言
    1.2 豆科植物的共生固氮與根瘤發(fā)育
        1.2.1 根瘤形成的分子機(jī)制
        1.2.2 豆科植物根瘤的結(jié)瘤自調(diào)控機(jī)制
    1.3 植物CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展
    1.4 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在大豆中的研究進(jìn)展
    1.5 高通量CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料和生長(zhǎng)條件
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株及載體
        2.1.3 試劑與藥品
        2.1.4 常用儀器
        2.1.5 培養(yǎng)基配方
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 高通量CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建
        2.2.2 大豆葉片DNA快速提取方法
        2.2.3 SSP(Specific sg RNA PCR)鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株sg RNA分布
        2.2.4 Sanger測(cè)序方法判定基因編輯方式
        2.2.5 大豆水培
        2.2.6 乙炔還原法測(cè)固氮酶活
        2.2.7 大豆根瘤RNA提取及基因表達(dá)量檢測(cè)
3 結(jié)果與分析
    3.1 大豆中目標(biāo)基因的選擇
    3.2 候選基因sg RNA的設(shè)計(jì)及混池轉(zhuǎn)化策略
    3.3 T0代陽(yáng)性植株中sg RNA分布與基因編輯效率統(tǒng)計(jì)
        3.3.1 T0代陽(yáng)性植株的sg RNA分布
        3.3.2 T0代陽(yáng)性植株的基因突變情況
    3.4 T1代基因編輯效率及轉(zhuǎn)基因元件的遺傳分離統(tǒng)計(jì)
    3.5 純合突變體的篩選鑒定和基因型分析
        3.5.1 突變體gmric1/ric2的基因型分析
        3.5.2 突變體gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3 的基因型分析
    3.6 純合突變體的表型鑒定與分析
        3.6.1 gmric1/ric2突變體表型鑒定與分析
        3.6.2 gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3 突變體表型鑒定與分析
4 討論
    4.1 高通量CRISPR/Cas9基因編輯載體可提高基因編輯效率
    4.2 gmric1/ric2和gmrdn1-1/rdn1-2/rdn1-3 突變體的應(yīng)用
    4.3 展望
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 人工合成引物列表
附錄B 庫(kù)A轉(zhuǎn)基因植株編輯情況統(tǒng)計(jì)
攻讀學(xué)位期間的學(xué)術(shù)論文與研究成果
致謝



本文編號(hào)：3953182