油菜雜種優(yōu)勢利用途徑很多,主要有兩類:細胞質(zhì)雄性不育和細胞核雄性不育。由于核不育,特別是隱性核不育,在雜種優(yōu)勢利用中的優(yōu)越性,最近幾年相繼在玉米、水稻等作物上,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),創(chuàng)建了新型核不育利用途徑。關(guān)鍵技術(shù)是獲得花粉粒特異表達啟動子。基于此,本研究首先從油菜中鑒定了一個花粉優(yōu)勢表達基因,并通過啟動子的截短等多種方法鑒定了啟動子的功能區(qū)域和它的一個反式作用因子,并將截短后的花粉特異表達啟動子片段應用于油菜隱性核不育系S45A的轉(zhuǎn)基因保持系的創(chuàng)建。主要研究結(jié)果如下:1.油菜小肽基因Bna.SP6的鑒定在中雙11中,我們克隆了ATSP6的2個同源基因Bn SP6_C08(611 bp)和Bn SP6_A08(475 bp),同時從花藥c DNA中克隆了它們的編碼區(qū)(246 bp)序列,命名為BnaC.SP6和Bna A.SP6。該編碼區(qū)都編碼一個包含81個氨基酸殘基的小肽前體,它們不包含任何已知功能的結(jié)構(gòu)域,而且N端都含有25個氨基酸的信號肽。RT-PCR和GUS染色結(jié)果表明BnaC.SP6是一個油菜晚期花藥和角果假隔膜表達的小肽基因。2.啟動子p...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1 文獻綜述
    1.1 花粉發(fā)育過程中對環(huán)境脅迫的響應
        1.1.1 植物花粉的發(fā)育過程
        1.1.2 環(huán)境脅迫對花粉發(fā)育的影響
    1.2 植物小肽編碼基因的分類及在花粉發(fā)育中的功能
    1.3 植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子及其順式作用元件
        1.3.1 bZIP基因家族的結(jié)構(gòu)與分類
        1.3.2 bZIP轉(zhuǎn)錄因子與DNA元件的結(jié)合
    1.4 花粉特異表達啟動子的分析、利用及其調(diào)控的研究
    1.5 核不育系的轉(zhuǎn)基因保持系的創(chuàng)制
        1.5.1 SPT技術(shù)
        1.5.2 異源花藥啟動子的轉(zhuǎn)錄沉默技術(shù)(pIRRNAsilencing)
    1.6 本研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 植物材料
    2.2 質(zhì)粒和生化試劑
    2.3 實驗方法
        2.3.1 總RNA的提取
        2.3.2 反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR
        2.3.3 Bna.SP6的克隆與序列分析
        2.3.4 啟動子全長及缺失載體的構(gòu)建
        2.3.5 啟動子的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化與分離比鑒定
        2.3.6 GUS染色、DAPI染色和亞歷山大染色
        2.3.7 GUS染色花藥的半薄切片
        2.3.8 GUS蛋白的定量
        2.3.9 酵母單雜交及轉(zhuǎn)錄激活分析
        2.3.10 凝膠阻滯電泳
        2.3.11 原生質(zhì)體的瞬時表達
        2.3.12 DEX誘導分析
        2.3.13 甘藍型油菜S45AB的遺傳轉(zhuǎn)化
3 結(jié)果與分析
    3.1 油菜中Bna.SP6的分離、鑒定及表達分析
        3.1.1 Bna.SP6的基因結(jié)構(gòu)和表達分析
        3.1.2 BnaC.SP6全長啟動子的分析
    3.2 BnaC.SP6啟動子的截短分析及GUS活性測定
        3.2.1 BnaC.SP6的啟動子截短分析
        3.2.2 BnaC.SP6啟動子截短片段的GUS活性分析
    3.3 最短的功能區(qū)域p158花粉表達時期分析
    3.4 BnaA.bZIP1的克隆及分析
        3.4.1 BnaA.bZIP1的克隆和表達模式
        3.4.2 BnaA.bZIP1的亞細胞定位
        3.4.3 BnaA.bZIP1的轉(zhuǎn)錄激活分析
    3.5 BnaA.bZIP1對BnaC.SP6的調(diào)控
        3.5.1 BnaA.bZIP1與啟動子p158的酵母點對點檢測
        3.5.2 BnaA.bZIP1的原核誘導與純化
        3.5.3 EMSA驗證BnaA.bZIP1與C-box的特異結(jié)合
        3.5.4 原生質(zhì)體瞬時檢測BnaA.bZIP1對p158活性的調(diào)控
        3.5.5 BnaA.bZIP1對BnaC.SP6的抑制
    3.6 核不育系S45A轉(zhuǎn)基因保持系的初步研究
        3.6.1 Bax基因?qū)ǚ壑滤佬脑u估
        3.6.2 載體元件的組合及油菜轉(zhuǎn)基因后代的測交評估
4 討論
    4.1 啟動子區(qū)域的截取及截短實驗的策略分析
    4.2 BnaC.SP6可能參與了花粉發(fā)育過程中的脅迫響應
    4.3 啟動子的兩個區(qū)域獨立控制BnaC.SP6在假隔膜和花粉中的表達
    4.4 BnaA.bZIP1是小肽基因BnaC.SP6的轉(zhuǎn)錄抑制子
    4.5 DEX誘導系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄因子與花粉特異啟動子互作驗證中的應用
    4.6 油菜核不育系的轉(zhuǎn)基因保持系
    4.7 下一步工作
參考文獻
附錄Ⅰ 分離比鑒定結(jié)果
附錄Ⅱ 作者簡介及在讀期間發(fā)表論文
致謝



本文編號：3878399