象草(Pennisetum purpureum)是禾本科狼尾草屬的多年生大型草本植物,是優(yōu)良飼用牧草及新型能源植物。但其體內(nèi)過高的木質(zhì)素含量限制了象草的開發(fā)與利用。所以,利用基因工程的方法,降低象草木質(zhì)素含量或改變木質(zhì)素組成對象草的利用具有重要意義。MYB轉(zhuǎn)錄因子及肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoy-CoA Reductase,CCR)基因啟動子都參與了木質(zhì)素的生物合成調(diào)控。本文研究了象草抑制型PpMYB4轉(zhuǎn)錄因子(登錄號為:KU612217)與PpCCR啟動子互作關(guān)系,以期為象草的木質(zhì)化改良工作奠定基礎(chǔ)。主要的研究結(jié)果如下:(1)構(gòu)建了一個以LUC以及REN為報告基因的雙熒光素酶報告檢測PpCCRPro-LUC載體和PpMYB4-SK載體,通過瞬轉(zhuǎn)煙草后測定熒光值發(fā)現(xiàn)PpMYB4與PpCCR啟動子(PpCCRPro)有明顯的互作,且能抑制了PpCCRPro的活性。(2)通過構(gòu)建PpCCRPro啟動GUS報告基因的表達(dá)載體PpCCRPro-GUS和pBA-PpMYB4載體,并瞬轉(zhuǎn)煙草,測定GUS酶活發(fā)現(xiàn),PpMYB4與PpCCRPro有明顯的互作,且抑制了PpCCRPro的活性。(3...

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮寫表
1 前言
    1.1 能源植物象草的研究進(jìn)展
    1.2 木質(zhì)素的基本結(jié)構(gòu)
    1.3 木質(zhì)素合成的調(diào)控
        1.3.1 木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶基因的調(diào)控
        1.3.2 環(huán)境因子及轉(zhuǎn)錄因子對木質(zhì)素合成調(diào)控
    1.4 轉(zhuǎn)錄因子
        1.4.1 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄因子MYB研究進(jìn)展
        1.4.3 MYB對木質(zhì)素合成的調(diào)控
    1.5 植物啟動子與轉(zhuǎn)錄因子互作研究方法
        1.5.1 雙熒光素酶報告基因檢測
        1.5.2 瞬時表達(dá)分析
        1.5.3 EMSA實驗
        1.5.4 染色質(zhì)免疫共沉淀實驗
    1.6 研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 菌種和質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑、試劑盒及來源
        2.1.4 主要試劑配置
    2.2 方法
        2.2.1 PpMYB4-SK載體的構(gòu)建
            2.2.1.1 目的片段的克隆
            2.2.1.2 PCR產(chǎn)物回收
            2.2.1.3 PCR產(chǎn)物的酶切與連接
            2.2.1.4 大腸桿菌Top10感受態(tài)制備
            2.2.1.5 重組載體的轉(zhuǎn)化
            2.2.1.6 重組載體的菌落PCR鑒定
            2.2.1.7 質(zhì)粒提取
            2.2.1.8 重組質(zhì)粒雙酶切的鑒定
        2.2.2 PpCCRPro-LUC載體的構(gòu)建
            2.2.2.1 目的片段的克隆
            2.2.2.2 酶切、連接與轉(zhuǎn)化
            2.2.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.2.3 雙熒光雙熒光素酶報告基因檢測研究
            2.2.3.1 EHA105感受態(tài)制備
            2.2.3.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
            2.2.3.3 準(zhǔn)備注射煙草葉片
            2.2.3.4 煙草葉片的注射
            2.2.3.5 檢測煙草葉片相對熒光值
        2.2.4 瞬時表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
            2.2.4.1 EHA105感受態(tài)制備
            2.2.4.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
        2.2.5 瞬時表達(dá)分析
            2.2.5.1 準(zhǔn)備煙草葉片注射
            2.2.5.2 煙草葉片的注射
            2.2.5.3 GUS酶活性測定
        2.2.6 凝膠遷移率實驗（EMSA）
            2.2.6.1 PpMYB4表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
            2.2.6.2 小量表達(dá)與鑒定
            2.2.6.3 蛋白大量表達(dá)及破菌檢測
            2.2.6.4 包涵體蛋白純化
            2.2.6.5 包涵體蛋白復(fù)性
            2.2.6.6 復(fù)性蛋白純化
            2.2.6.7 DNA探針的設(shè)計
            2.2.6.8 DNA探針的標(biāo)記
            2.2.6.9 生物素標(biāo)記探針標(biāo)記效率的檢測
            2.2.6.10 EMSA膠的配制及EMSA結(jié)合反應(yīng)
            2.2.6.11 電泳
            2.2.6.12 轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)
            2.2.6.13 化學(xué)發(fā)光檢測
        2.2.7 染色體免疫共沉淀（ChIP）實驗載體的構(gòu)建
            2.2.7.1 目的片段的克隆
            2.2.7.2 酶切、連接與轉(zhuǎn)化
            2.2.7.3 重組子的鑒定
        2.2.8 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.8.1 EHA105感受態(tài)制備
            2.2.8.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
            2.2.8.3 煙草葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.9 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定
            2.2.9.1 DNA提取
            2.2.9.2 PCR鑒定
            2.2.9.3 半定量RT-PCR鑒定
        2.2.10 ChIP實驗
            2.2.10.1 組織固定及交聯(lián)
            2.2.10.2 核酸分離及片段化
            2.2.10.3 預(yù)洗滌
            2.2.10.4 免疫沉淀
            2.2.10.5 反交聯(lián)
            2.2.10.6 qPCR檢測富集效率
            2.2.10.7 瓊脂糖凝膠鑒定
        2.2.11 象草PpCCRPro-PpMYB4過表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.11.1 目的片段的克隆
            2.2.11.2 酶切、連接與轉(zhuǎn)化
            2.2.11.3 重組子的鑒定
        2.2.12 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.12.1 感受態(tài)EHA105的制備
            2.2.12.2 凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
            2.2.12.3 煙草的葉盤法轉(zhuǎn)化
        2.2.13 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定
            2.2.13.1 DNA的提取以及PCR鑒定
        2.2.14 木質(zhì)素含量的測定
            2.2.14.1 木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
            2.2.14.2 木質(zhì)素含量測定
        2.2.15 植物激素處理
        2.2.16 實時熒光定量PCR
            2.2.16.1 總RNA的提取及c DNA第一鏈合成
            2.2.16.2 qPCR實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果分析
        3.1.1 PpMYB4-SK載體的構(gòu)建
        3.1.2 PpCCRPro-LUC載體的構(gòu)建
        3.1.3 雙熒光素酶報告基因檢測互作分析
    3.2 瞬時表達(dá)研究分析
        3.2.1 瞬時表達(dá)載體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的鑒定
        3.2.2 瞬時表達(dá)GUS酶活性測定
    3.3 凝膠遷移率實驗（EMSA）結(jié)果分析
        3.3.1 融合蛋白提取純化結(jié)果
        3.3.2 探針標(biāo)記效率結(jié)果
        3.3.3 EMSA檢測結(jié)果
            3.3.3.1 PpMYB4蛋白和探針互作檢測結(jié)果
            3.3.3.2 PpMYB4蛋白與探針PpCCR-2 競爭檢測結(jié)果
    3.4 ChIP實驗結(jié)果分析
        3.4.1 HA-pBA002-PpMYB4實驗表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4.2 HA-pBA002-PpMYB4轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
        3.4.3 RT-PCR鑒定
        3.4.4 ChIP-PCR鑒定
    3.5 表達(dá)載體PpCCRPro-PpMYB4異源表達(dá)分析
        3.5.1 表達(dá)載體PpCCRPro-PpMYB4的構(gòu)建
        3.5.2 轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測
        3.5.3 RT-PCR鑒定
        3.5.4 轉(zhuǎn)基因植株表型及木質(zhì)素含量的測定
        3.5.5 木質(zhì)素合成相關(guān)基因的測定
        3.5.6 激素對木質(zhì)素合成相關(guān)基因的影響
4 討論
    4.1 PpCCRPro與PpMYB4轉(zhuǎn)錄因子互作研究
        4.1.1 雙熒光素報告基因檢測的研究
        4.1.2 瞬時表達(dá)分析研究
        4.1.3 凝膠遷移率實驗（EMSA）研究
        4.1.4 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）研究
    4.2 PpCCRPro-PpMYB4在煙草中過表達(dá)研究
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄A 引物表
附錄B 標(biāo)準(zhǔn)曲線
附錄C EMAS探針序列



本文編號：3852338