發(fā)布時(shí)間：2023-08-07 17:55

　　減數(shù)分裂是有性生殖生物世代交替的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在此過程中同源染色體完成識別、配對、聯(lián)會、非姊妹染色單體間的片段交換及分離等一系列重要事件。配對的同源染色體間會形成聯(lián)會復(fù)合體,交換于此完成。模式植物擬南芥中,AtZYP1是形成聯(lián)會復(fù)合體的橫向細(xì)絲蛋白。zyp1突變體減數(shù)分裂中,聯(lián)會復(fù)合體不能形成,同源染色體間的交換數(shù)量顯著減少,但是部分同源染色體間的交換增加。甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L)為異源四倍體,基因組復(fù)雜,且由于缺少相關(guān)突變體,減數(shù)分裂遺傳調(diào)控方面的研究較少。本研究中,我們利用CRISPR技術(shù),對甘藍(lán)型油菜ZYP1的四個(gè)同源基因進(jìn)行編輯,獲得突變體材料,研究其在甘藍(lán)型油菜減數(shù)分裂中的功能。利用這些突變體為中間材料,也可能促進(jìn)油菜染色體與近緣種染色體間的交換,從而將近緣種優(yōu)異基因?qū)胗筒酥�。主要研究結(jié)果如下:(1)利用擬南芥AtZYP1序列進(jìn)行同源比對,在白菜、甘藍(lán)與甘藍(lán)型油菜中分別發(fā)現(xiàn)2、2與4個(gè)同源基因。以這些基因序列為基礎(chǔ),構(gòu)建了同時(shí)靶向甘藍(lán)型油菜BnZYP1四個(gè)拷貝的雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜Westar,T₀

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
1 前言
    1.1 同源重組分子機(jī)制
        1.1.1 減數(shù)分裂的一般過程
        1.1.2 雙鏈斷裂的產(chǎn)生與修復(fù)
        1.1.3 同源染色體的識別、配對與聯(lián)會復(fù)合體形成
        1.1.4 交換的形成
    1.2 聯(lián)會復(fù)合體的組分及其功能
        1.2.1 聯(lián)會復(fù)合體主要蛋白組分
        1.2.2 聯(lián)會復(fù)合體的功能
        1.2.3 ZYP影響同源/部分同源染色體配對與交換發(fā)生
    1.3 減數(shù)分裂的遺傳調(diào)控及其在育種中的應(yīng)用
        1.3.1 減數(shù)分裂進(jìn)程的改變
        1.3.2 交換頻率與位置的遺傳調(diào)控
    1.4 甘藍(lán)型油菜減數(shù)分裂的相關(guān)研究
        1.4.1 甘藍(lán)型油菜的起源與進(jìn)化
        1.4.2 甘藍(lán)型油菜減數(shù)分裂相關(guān)基因的定位與克隆
    1.5 CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)展及其應(yīng)用
        1.5.1 CRISPR/Cas發(fā)現(xiàn)及發(fā)展
        1.5.2 CRISPR/Cas的類型及作用原理
        1.5.3 CRISPR/Cas9 在遺傳育種中的應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
2.實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 載體和菌株
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)常用試劑與耗材
        2.1.4 引物合成與PCR產(chǎn)物測序
        2.1.5 目的基因序列獲取及分析
        2.1.6 雙靶點(diǎn)CRISPR/Cas9 載體的構(gòu)建
        2.1.7 電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101
        2.1.8 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化
        2.1.9 轉(zhuǎn)基因植株的檢測
        2.1.10 轉(zhuǎn)基因植株靶位點(diǎn)編輯檢測
        2.1.11 普通細(xì)胞學(xué)分析
3.結(jié)果與分析
    3.1 Bn ZYP1 不同拷貝間的進(jìn)化關(guān)系
    3.2 Bn ZYP1 不同拷貝基因結(jié)構(gòu)與在氨基酸水平的變異
    3.3 靶點(diǎn)的選擇與載體構(gòu)建
        3.3.1 BnZYP1 基因sgRNA的選擇
        3.3.2 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
    3.4 轉(zhuǎn)基因T₀ 代植株陽性鑒定
    3.5 T₀代BnZYP1 編輯位點(diǎn)檢測
        3.5.1 測序特異性引物的設(shè)計(jì)
        3.5.2 T₀代Bn ZYP1 突變類型
        3.5.3 T₀ 代突變體Bn ZYP1 氨基酸變化
    3.6 突變的遺傳分析
        3.6.1 T₁ 代轉(zhuǎn)基因植株核苷酸變化
        3.6.2 T₁代Bn ZYP1 轉(zhuǎn)基因植株氨基酸變化
    3.7 Bnzyp1 突變植株表型
        3.7.1 雄蕊發(fā)育
        3.7.2 花粉可染性
        3.7.3 減數(shù)分裂染色體行為
4.討論
    4.1 利用CRISPR/Cas9 編輯多拷貝基因
    4.2 CRISPR/Cas9 在甘藍(lán)型油菜中的突變特點(diǎn)
    4.3 Bn ZYP1 在甘藍(lán)型油菜減數(shù)分裂中的作用
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1 構(gòu)建載體引物
    附錄2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR初步檢測引物
    附錄3 陽性植株測序所用引物
    附錄4 PAGE檢測所用引物
    附錄5 陽性植株測序峰圖
    附錄6 培養(yǎng)基的配置
    附錄7 CTAB法提取DNA
致謝



本文編號：3840082