黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)為茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium L.)多年生灌木,主要分布于我國西北地區(qū)。其成熟的果實(shí)中富含花色苷和原花青素等多種具有抗氧化活性的有效成分,為少數(shù)民族常用藥。但目前對黑果枸杞活性成分的生物合成途徑研究較少,有關(guān)生長過程中有效成分的積累與動態(tài)變化規(guī)律尚不明確。鑒于此,本研究以不同生長時(shí)期的黑果枸杞果實(shí)為研究材料,采用PCR克隆獲得了控制花色苷及原花青素生物合成的關(guān)鍵酶基因,一方面從化學(xué)成分含量和關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量來研究活性成分的積累與動態(tài)變化規(guī)律,尋找有效成分的最大積累期,進(jìn)而確定黑果枸杞漿果的最佳采收期;另一方面將關(guān)鍵酶基因構(gòu)建到病毒誘導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)載體上,并觀察異源表達(dá)此類基因的煙草中有效成分變化情況。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.利用高保真酶擴(kuò)增獲得控制黑果枸杞果實(shí)中花色苷和原花青素合成的關(guān)鍵酶基因—LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR,其序列全長分別為1140、1251、1002和1017 bp,經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其分別編碼大小為379、416、333和338 aa的蛋白質(zhì),均具有相應(yīng)蛋白家族的特征位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)域...

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
第一章 前言
    1.1 黑果枸杞的研究概述
        1.1.1 黑果枸杞的抗逆性與繁殖
        1.1.2 活性成分研究
    1.2 花色苷與原花青素的次生代謝研究
        1.2.1 花色苷與原花青素的生物合成途徑
        1.2.2 花色苷及原花青素代謝通路下游關(guān)鍵酶及其基因的研究
    1.3 瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)與植物病毒載體的研究進(jìn)展
        1.3.1 植物病毒載體的特點(diǎn)及構(gòu)建
        1.3.2 馬鈴薯X病毒表達(dá)載體
    1.4 研究目的及意義
第二章 黑果枸杞花色苷及原花青素生物合成關(guān)鍵酶基因的克隆及相關(guān)分析
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 試劑及緩沖液
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 黑果枸杞RNA提取及cDNA合成
        2.2.2 關(guān)鍵酶基因PCR擴(kuò)增
        2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
        2.2.4 連接、轉(zhuǎn)化及重組鑒定
        2.2.5 基因及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR基因序列分析
        2.3.2 LrDFR、LrANS、LrLAR和LrANR蛋白結(jié)構(gòu)及性質(zhì)分析
    2.4 小結(jié)與討論
        2.4.1 核苷酸及氨基酸序列的差異性
        2.4.2 酶蛋白結(jié)構(gòu)域及活性位點(diǎn)的保守性
第三章 黑果枸杞中花青素及原花青素積累規(guī)律研究
    3.1 材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 試劑及緩沖液
        3.1.3 主要儀器設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 黑果枸杞生長過程中花色苷的積累變化
        3.2.2 黑果枸杞生長過程中原花青素的積累變化
        3.2.3 黑果枸杞生長過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 黑果枸杞生長過程中花色苷的代謝變化
        3.3.2 黑果枸杞生長過程中原花青素的代謝變化
        3.3.3 不同時(shí)期關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析
    3.4 小結(jié)與討論
        3.4.1 黑果枸杞中花色苷的積累代謝規(guī)律
        3.4.2 黑果枸杞中原花青素的積累代謝規(guī)律
第四章 關(guān)鍵酶基因的病毒載體構(gòu)建及其在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)研究
    4.1 材料
        4.1.1 植物材料和菌種
        4.1.2 試劑及緩沖液
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 LrANS、LrLAR及LrANR基因的pMD18T載體質(zhì)粒提取
        4.2.2 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.3 重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌
        4.2.4 農(nóng)桿菌浸染普通煙
        4.2.5 瞬時(shí)表達(dá)煙草的花色苷及原花青素的含量測定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果
        4.3.2 轉(zhuǎn)化煙草中花色苷與原花青素的含量變化
    4.4 小結(jié)與討論
        4.4.1 LrANS-pGR107的瞬時(shí)表達(dá)分析
        4.4.2 LrLAR-pGR107和LrANR-pGR107的瞬時(shí)表達(dá)分析
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
Abstract
附錄A: 本文所用主要縮寫詞及中英文對照
附錄B: 本文所用的化學(xué)試劑和緩沖液的配制
附錄C: 本文擴(kuò)增獲得的酶基因序列
致謝



本文編號：3837782