馬鈴薯是我國重要的糧食作物。由于馬鈴薯遺傳背景復雜、自交不親和等特性,新品種培育進程緩慢,鮮食、加工專用的高品質(zhì)馬鈴薯品種匱乏。利用生物技術(shù)手段對作物進行改造,能夠有效縮短育種進程。原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)能夠避免外源基因在植物基因組上的整合,可以通過后期篩選獲得具有目的性狀且無外源基因整合的新種質(zhì)材料。本研究旨在建立一套用于CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化的高效馬鈴薯原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化再生體系,為馬鈴薯遺傳改良和新種質(zhì)資源創(chuàng)造提供技術(shù)支撐。以馬鈴薯栽培種大西洋為材料,針對原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化及再生兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié),研究酶解液濃度、時間、滲透壓、外源激素和起始密度等關(guān)鍵因素,建立并優(yōu)化體系。選取文獻報道的StGBSS基因外顯子9上20 bp序列(GBSS9)為靶位點,構(gòu)建pCAMBIA2300-GBSS載體。利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)在葉肉原生質(zhì)體進行瞬時轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:1.對分離條件進行了優(yōu)化,初步確定纖維素酶濃度為0.7%,滲透壓為0.4 M甘露醇濃度,酶解時間8-9 h,為原生質(zhì)體分離的最佳條件。2.對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)外源激素2,4-D的濃度為2 mg/L、起始密度為0.5...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
一.前言
    1.1 馬鈴薯育種現(xiàn)狀及存在的問題
        1.1.1 我國馬鈴薯育種現(xiàn)狀
        1.1.2 馬鈴薯品種傳統(tǒng)選育技術(shù)存在的問題
    1.2 植物原生質(zhì)體在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用及優(yōu)勢
        1.2.1 植物原生質(zhì)體分離與再生的影響因素
        1.2.2 原生質(zhì)體在育種方面的應(yīng)用
        1.2.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系對馬鈴薯新品種培育的重要作用和意義
    1.3 基因編輯技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用
        1.3.1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)
        1.3.2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在作物中的應(yīng)用及存在的問題
        1.3.3 CRISPR/Cas9基因編輯對馬鈴薯新品種培育的重要作用和意義
    1.4 研究目的及意義
二.實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 載體
    2.2 試劑與儀器
    2.3 研究內(nèi)容
    2.4 實驗方法
        2.4.1 馬鈴薯原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化
        2.4.2 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)條件優(yōu)化及再生
        2.4.3 載體的構(gòu)建及馬鈴薯原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
        2.4.4 轉(zhuǎn)化株的再生與鑒定
三.實驗結(jié)果與討論
    3.1 馬鈴薯原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化
        3.1.1 酶解液最適濃度的篩選
        3.1.2 酶解時間對原生質(zhì)體分離的影響
        3.1.3 滲透壓對原生質(zhì)體分離的影響
    3.2 馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)條件優(yōu)化
        3.2.1 外源激素(2,4-D)濃度對原生質(zhì)體分裂的影響
        3.2.2 培養(yǎng)起始密度對原生質(zhì)體分裂的影響
        3.2.3 原生質(zhì)體的分裂
        3.2.4 原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)
    3.3 CRISPR/Cas9瞬時轉(zhuǎn)化及植株再生鑒定
        3.3.1 載體構(gòu)建
        3.3.2 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化及再生
        3.3.3 轉(zhuǎn)化株的鑒定
四.全文總結(jié)
參考文獻
附錄1
附錄2
附錄3
致謝



本文編號：3825305