植物蛋白的特異性糖苷修飾一直被懷疑具有潛在的免疫原性,進(jìn)入人體后可能具有安全性風(fēng)險(xiǎn),因而限制了它的進(jìn)一步應(yīng)用。但這些數(shù)據(jù)均來(lái)自于葉片而不是種子,對(duì)種子蛋白的糖苷類型的研究非常有限,而關(guān)于其免疫原性的報(bào)道則基本沒(méi)有。水稻胚乳是一種經(jīng)濟(jì)有效的生物反應(yīng)器,因此,研究種子和葉片的糖苷類型差異以及植物特異性糖苷的免疫原性,對(duì)水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器的應(yīng)用具有重要意義。在本研究中,為了探討水稻胚乳細(xì)胞蛋白的糖苷修飾與葉片蛋白修飾間的差異以及植物特異性糖苷的免疫原性,我們首先獲得了水稻胚乳特異性表達(dá)的人α-1,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(FUT8)基因和β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GalT)基因水稻品系。為了加快育種進(jìn)程,我們優(yōu)化了一種利用水稻基因RBE4作為內(nèi)參的定量PCR法,用于快速準(zhǔn)確地篩選純合子單株和鑒定轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)。通過(guò)雜交,把FUT8、GalT和hAAT(人α抗胰蛋白酶)這三個(gè)基因聚合起來(lái),獲得了部分人源化糖苷修飾的AAT轉(zhuǎn)基因水稻品系,然后比較了不同糖苷修飾的AAT的糖基化結(jié)構(gòu),并對(duì)其免疫原性做出評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下:1.通過(guò)MALDI-TOF MS分析,我們發(fā)現(xiàn)水稻葉片和種子蛋白的糖苷修飾存在...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    第一節(jié) 生物制藥的發(fā)展及現(xiàn)狀
    第二節(jié) 生物制藥的種類
        1.2.1 抗體類藥物
        1.2.2 重組蛋白類藥物
        1.2.3 疫苗
        1.2.4 細(xì)胞因子
        1.2.5 其他
    第三節(jié) 用于生物制藥的各種表達(dá)體系
        1.3.1 微生物生物反應(yīng)器
        1.3.2 動(dòng)物生物反應(yīng)器
        1.3.3 植物生物反應(yīng)器
            1.3.3.1 植物生物反應(yīng)器的宿主研究進(jìn)展
            1.3.3.2 不同類型植物生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展
    第四節(jié) 糖蛋白的N-糖基化修飾的研究進(jìn)展
        1.4.1 N-糖基化修飾的功能及特點(diǎn)
            1.4.1.1 N-糖基化修飾對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響
            1.4.1.2 N-糖基化修飾的不均一性
            1.4.1.3 N-糖基化修飾對(duì)生物蛋白藥物功能的重要作用
        1.4.2 不同表達(dá)體系中N-糖基化修飾的差異
            1.4.2.1 動(dòng)物和植物中N-糖基化修飾的不同
            1.4.2.2 不同物種間N-糖基化修飾的差異
            1.4.2.3 不同器官和組織間N-糖基化修飾的差異
            1.4.2.4 不同細(xì)胞器中N-糖基化修飾的差異
            1.4.2.5 不同生長(zhǎng)周期中N-糖基化修飾的不同
        1.4.3 植物特異性N-糖基化修飾的免疫原性
    第五節(jié) 植物細(xì)胞人源化N-糖基化修飾的研究進(jìn)展
第二章 水稻不同品種及不同組織的糖基化修飾
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        2.2.1 供試材料品種
        2.2.2 總蛋白提取
        2.2.3 糖苷的分離與純化
        2.2.4 MALDI-TOF MS
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 水稻不同品種種子蛋白的N-糖基化修飾分析
        2.3.2 水稻不同品種葉片的N-糖基化修飾研究
        2.3.3 水稻種子和葉片蛋白的N-糖基化修飾類型比較
        2.3.4 水稻種子和葉片中N-連接糖苷定量分析
    第四節(jié) 小結(jié)和討論
第三章 水稻胚乳中人源化糖苷修飾研究
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        3.2.1 載體構(gòu)建和水稻轉(zhuǎn)化
        3.2.2 水稻種子的總蛋白提取
        3.2.3 水稻種子儲(chǔ)藏谷蛋白提取
        3.2.4 Western blotting分析
        3.2.5 轉(zhuǎn)基因單株的純合子篩選
        3.2.6 水稻胚乳儲(chǔ)藏谷蛋白的糖基化結(jié)構(gòu)分析
        3.2.7 α-1,6-巖藻糖含量的定量分析
        3.2.8 轉(zhuǎn)基因的聚合
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 過(guò)量表達(dá)FUT8和GalT基因的轉(zhuǎn)基因植株的獲得
        3.3.2 轉(zhuǎn)基因水稻種子中谷蛋白的N-連接糖苷結(jié)構(gòu)分析
    第四節(jié) 小結(jié)和討論
第四章 不同糖苷修飾背景下人α抗胰蛋白酶的糖基化修飾分析
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 純合子篩選
        4.2.3 Western blotting分析
        4.2.4 重組AAT的純化
        4.2.5 重組AAT糖基結(jié)構(gòu)分析
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 表達(dá)人源化糖苷修飾的AAT轉(zhuǎn)基因品系選育
        4.3.2 重組AAT的純化與分析
        4.3.3 OsrAAT和mgOsrAAT的N-糖基化結(jié)構(gòu)分析
    第四節(jié) 小結(jié)和討論
第五章 OsrAAT和mgOsrAAT免疫原性的比較
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 家兔免疫
            5.2.2.1 樣品配置
            5.2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組
            5.2.2.3 給藥方法
            5.2.2.4 樣本采集及處理
            5.2.2.5 一般臨床觀察
            5.2.2.6 血清中抗體效價(jià)測(cè)定
            5.2.2.7 血清中AAT特異IgG、IgM和IgE的測(cè)定
        5.2.3 被動(dòng)致敏實(shí)驗(yàn)
            5.2.3.1 動(dòng)物分組
            5.2.3.2 致敏
            5.2.3.3 激發(fā)
            5.2.3.4 結(jié)果判定
        5.2.4 血清中植物特異性糖苷的抗體濃度檢測(cè)
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 一般臨床觀察
        5.3.2 不同來(lái)源AAT的抗體效價(jià)分析
        5.3.3 血清中抗AAT的IgG、IgM和IgE含量分析
        5.3.4 豚鼠皮膚被動(dòng)過(guò)敏
        5.3.5 血清中植物特異性α-1,3-巖藻糖和β-1,2-木糖的抗體濃度
    第四節(jié) 小結(jié)和討論
附 一種快速鑒定轉(zhuǎn)基因純合子及拷貝數(shù)的方法
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料和方法
        2.1 供本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因品系
        2.2 基因組DNA提取
        2.3 PCR擴(kuò)增和引物
        2.4 SYBR Green定量PCR
        2.5 轉(zhuǎn)基因純合子的鑒定
        2.6 純合子植株的PCR驗(yàn)證
        2.7 轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的確定
        2.8 Southern雜交分析
    第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 用于純合子鑒定的內(nèi)參基因的選擇
        3.2 利用Ct值(2^-△△Ct)鑒定轉(zhuǎn)基因植株的純合子和雜合子
        3.3 在T2代中驗(yàn)證已檢測(cè)出的純合子的準(zhǔn)確性
        3.4 用于確定插入位點(diǎn)數(shù)及驗(yàn)證
    第四節(jié) 小結(jié)和討論
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的文章及專利
專利及獎(jiǎng)勵(lì)
致謝



本文編號(hào)：3789053