三分三(Anisodus acutangulus)是我國云南特有的茄科山莨菪屬的多年生草本植物,由于能夠產(chǎn)生托品烷生物堿而被廣泛關(guān)注。三分三中生物堿的總含量達到1.2%,比世界上其它一些茄科植物如天仙子(Hyoscyamus niger),顛茄(Atropa belladonna),曼陀羅(Datura Stramonium)等中的含量都要高的多,是開發(fā)和利用生物堿的不可多得的一種植物資源,因此作為藥用植物它具有重要的研究意義和應(yīng)用價值。托品烷類生物堿是一類來自茄科植物的次生代謝產(chǎn)物主要包括莨菪堿(Hyoscyamine)、山莨菪堿(Anisodamine)、樟柳堿(Anisodine)和東莨菪堿(Scopolamine)。它是一類具有巨大藥用價值的抗膽堿藥物,主要作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng),具有鎮(zhèn)痛、止咳、麻醉,抗暈動癥等作用,其中莨菪堿和東莨菪堿被廣泛應(yīng)用于臨床治療,市場需求十分巨大。因此利用基因工程手段提高三分三中莨菪堿和東莨菪堿的產(chǎn)量,將有效緩解市場緊張的供求矛盾。本論文以三分三為材料,運用分子生物學手段,首次從三分三中克隆了一條WRKY轉(zhuǎn)錄因子AaWRKY23。分析了該轉(zhuǎn)錄因子的生...

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 三分三簡介
    1.2 生物堿概述
    1.3 托品烷生物堿概述
        1.3.1 莨菪堿（Hyoscyamine）
        1.3.2 東莨菪堿（Hyoscyamine）
        1.3.3 山莨菪堿（Anisodamine）
        1.3.4 樟柳堿（Anisodine）
    1.4 托品烷生物堿的合成方式
    1.5 托品烷生物堿的合成途徑
        1.5.1 腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PMT)
        1.5.2 托品酮還原酶I(TRI)和托品酮還原酶II(TRII)
        1.5.3 莨菪堿6-β羥化酶(H6H)
    1.6 提高托品烷生物堿含量的方法
        1.6.1 單基因或多基因共轉(zhuǎn)化策略
        1.6.2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控策略
        1.6.3 反義或RNAi干擾策略
        1.6.4 誘導(dǎo)策略
    1.7 WRKY轉(zhuǎn)錄因子
        1.7.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子概述
        1.7.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點
        1.7.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能
    1.8 本課題的研究目的和研究意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 載體與菌種
        2.1.3 主要的儀器設(shè)備
        2.1.4 常用的試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 三分三無菌苗的快繁
        2.2.2 三分三WRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選
        2.2.3 AaWRKYs的進化樹分析、序列對比、分組和保守結(jié)構(gòu)域的識別
        2.2.4 組織表達譜分析
        2.2.5 AaWRKY23基因的克隆
        2.2.6 AaWRKY23的亞細胞定位
        2.2.7 植物表達載體的構(gòu)建
        2.2.8 農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.9 AaWRKY23轉(zhuǎn)基因毛狀根的陽性鑒定
        2.2.10 三分三轉(zhuǎn)基因毛狀根陽性克隆的qRT-PCR分析
        2.2.11 AaWRKY23轉(zhuǎn)基因三分三毛狀根有效成分的檢測
        2.2.12 酵母單雜交實驗
        2.2.13 Dual-Luc實驗
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 目的基因的篩選
        3.1.1 AaWRKYs的命名和分類
        3.1.2 AaWRKYs的多重序列比對以及保守結(jié)構(gòu)域的識別
        3.1.3 托品烷生物堿合成途徑中關(guān)鍵酶基因的組織表達譜分析
        3.1.4 AaWRKYs的組織表達譜分析
        3.1.5 AaWRKYs與其它WRKYs的系統(tǒng)進化樹分析
    3.2 AaWRKY23基因的克隆
    3.3 AaWRKY23的生物信息學分析
        3.3.1 AaWRKY23的進化樹分析
        3.3.2 AaWRKY23的多重序列比對
        3.3.3 AaWRKY23的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測
    3.4 AaWRKY23的亞細胞定位分析
        3.4.1 載體pHB::AaWRKY23-YFP的構(gòu)建
        3.4.2 亞細胞定位結(jié)果分析
    3.5 植物表達載體的構(gòu)建
        3.5.1 過表達載體pHB::AaWRKY23-YFP的構(gòu)建
    3.6 農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)的三分三外植體的遺傳轉(zhuǎn)化
    3.7 三分三轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR陽性鑒定
        3.7.1 pHB-YFP空載轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR陽性鑒定
        3.7.2 pHB::AaWRKY23-YFP過表達轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR陽性鑒定
    3.8 AaWRKY23轉(zhuǎn)基因毛狀根的qRT-PCR分析以及HPLC含量測定
        3.8.1 AaWRKY23過表達轉(zhuǎn)基因毛狀根的篩選
        3.8.2 AaWRKY23過表達轉(zhuǎn)基因毛狀根株系中TAs生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的定量PCR分析
        3.8.3 AaWRKY23過表達轉(zhuǎn)基因毛狀根中托品烷生物堿含量測定
    3.9 酵母單雜實驗
        3.9.1 placz2u表達載體構(gòu)建
        3.9.2 pB42AD載體的構(gòu)建
        3.9.3 酵母單雜實驗
    3.10 Dual-Luc實驗
        3.10.1 pGreen0800載體的構(gòu)建
        3.10.2 Dual-Luc實驗結(jié)果分析
第四章 研究總結(jié)與展望
    4.1 研究總結(jié)
    4.2 研究展望
參考文獻
論文及成果
致謝
附件



本文編號：3758807