轉(zhuǎn)錄因子在水稻逆境脅迫應(yīng)答過程中起到關(guān)鍵的作用,通過揭示轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)水稻鹽脅迫中的作用機制及原理,隨后通過基因工程手段改良水稻植物體中的相關(guān)基因,促使有效的耐鹽基因發(fā)揮功能作用,從而達(dá)到提高水稻耐鹽性的效果。目前已經(jīng)克隆得到的水稻耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子大概有30多個,這些基因在調(diào)節(jié)水稻不同發(fā)育時期的耐鹽性方面,有著重要的作用。已知的轉(zhuǎn)錄因子有DREB,NAC,MYB,MYC,Cys2/His2 zinc finger,bZIP,AP2/ERF,WRKY等幾大家族。本論文以實驗室前期分離鑒定得到的水稻耐鹽突變體rst1為研究對象,利用酵母雙雜交技術(shù)從水稻基因文庫中篩選出與轉(zhuǎn)錄因子RST1互作的蛋白質(zhì),并構(gòu)建相關(guān)的水稻轉(zhuǎn)基因材料研究其基本生理特征及耐鹽性,初步為研究突變體rst1的耐鹽機理提供了參考依據(jù)。具體研究如下:首先,本研究利用酵母雙雜交技術(shù)從實驗室構(gòu)建好的水稻基因文庫中篩選出與轉(zhuǎn)錄因子RST1有互作關(guān)系的蛋白質(zhì),經(jīng)過回轉(zhuǎn)驗證,最終確定其中的三個陽性互作蛋白,包括 CBSX3(CBS domain containing protein,CDCP)和熱激蛋白 Hsp40 及一個未知蛋白。隨...

【文章頁數(shù)】：90 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號及縮略語表
緒論
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 植物的鹽脅迫研究進(jìn)展
        1.1 土壤鹽漬化概述
        1.2 植物適應(yīng)鹽脅迫的機制
            1.2.1 植物對鹽脅迫信號的感知
            1.2.2 植物體內(nèi)Na⁺的轉(zhuǎn)運和解毒通路
    2 轉(zhuǎn)錄因子與植物耐鹽性
    3 轉(zhuǎn)錄因子的修飾
    4 研究目的及意義
第二章 RST1互作蛋白的篩選及驗證
    引言
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 pGBKT7-RST1載體的構(gòu)建
            1.2.1 OsRST1的CDS序列克隆
            1.2.2 基因和載體的酶切:
            1.2.3 質(zhì)粒的連接
            1.2.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            1.2.5 菌落PCR鑒定陽性克隆
            1.2.6 質(zhì)粒的提取
            1.2.7 雙酶切鑒定及測序
        1.3 酵母雙雜交篩庫
            1.3.1 制備酵母感受態(tài)
            1.3.2 轉(zhuǎn)化
            1.3.3 毒性與自激活檢測
            1.3.4 酵母融合
        1.4 互作驗證
            1.4.1 酵母雙雜載體構(gòu)建
            1.4.2 Pull-down載體構(gòu)建
            1.4.3 BiFC載體構(gòu)建
            1.4.4 基因與載體的酶切與連接
            1.4.5 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        1.5 酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗證
            1.5.1 酵母感受態(tài)制備
            1.5.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化
            1.5.3 涂板
            1.5.4 酵母點斑
        1.6 Pull-down
            1.6.1 轉(zhuǎn)化
            1.6.2 原核表達(dá)蛋白
            1.6.3 Pull-down
        1.7 雙分子熒光互補BiFC
            1.7.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
            1.7.2 農(nóng)桿菌侵染煙草
    2 結(jié)果分析
        2.1 酵母雙雜交篩庫
            2.1.1 酵母菌落PCR
            2.1.2 酵母質(zhì)粒提取送樣測序
        2.2 回轉(zhuǎn)驗證(酵母雙雜交)
            2.2.1 CDS全長回轉(zhuǎn)驗證
            2.2.2 結(jié)構(gòu)域截段回轉(zhuǎn)驗證
        2.3 Pull-down
        2.4 雙分子熒光互補BiFC
    3 討論
第三章 RST1互作蛋白CBSX3的定位及其耐鹽功能分析
    引言
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 OsCBSX3的表達(dá)模式分析
            1.2.1 組織定量
            1.2.2 GUS組織定位
        1.3 亞細(xì)胞定位
            1.3.1 煙草亞細(xì)胞定位
            1.3.2 洋蔥表皮亞細(xì)胞定位
        1.4 水稻轉(zhuǎn)基因材料構(gòu)建
            1.4.1 水稻OE-CBSX3過表達(dá)株系構(gòu)建
            1.4.2 水稻RNAi-CBSX3干擾株系構(gòu)建
        1.5 野生型水稻的脅迫處理
            1.5.1 鹽脅迫
            1.5.2 干旱脅迫
        1.6 OE-CBSX3過表達(dá)株系的鹽處理
            1.6.1 鹽處理
            1.6.2 過表達(dá)株系的定量分析
            1.6.3 Na⁺、K⁺測定
    2 結(jié)果分析
        2.1 組織定位
            2.1.1 OsCBSX3的組織表達(dá)模式
        2.2 亞細(xì)胞定位
            2.2.1 煙草亞細(xì)胞定位
            2.2.2 洋蔥表皮亞細(xì)胞定位
        2.3 OsCBSX3對脅迫的響應(yīng)
            2.3.1 OsCBSX3對鹽脅迫的響應(yīng)
            2.3.2 OsCBSX3對干旱脅迫的響應(yīng)
        2.4 OE-CBSX3過表達(dá)株系的鹽處理
            2.4.1 鹽處理表型分析
            2.4.2 存活率
            2.4.3 鹽處理前后Na⁺、K⁺含量
            2.4.4 過表達(dá)株系中OsCBSX3和OsRST1的表達(dá)量分析
    3 討論
第四章 RST1互作蛋白Hsp40的定位及其耐鹽功能分析
    引言
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
        1.2 亞細(xì)胞定位
            1.2.1 載體構(gòu)建
        1.3 OE-Hsp40過表達(dá)株系的鹽處理
            1.3.1 熒光定量引物設(shè)計
            1.3.2 過表達(dá)載體構(gòu)建
    2 結(jié)果分析
        2.1 亞細(xì)胞定位
            2.1.1 煙草亞細(xì)胞定位
            2.1.2 洋蔥表皮亞細(xì)胞定位
        2.2 OsHsp40對脅迫的響應(yīng)
            2.2.1 對鹽脅迫的響應(yīng)
            2.2.2 對干旱脅迫的響應(yīng)
        2.3 OE-Hsp40過表達(dá)株系的鹽處理
            2.3.1 鹽處理表型
            2.3.2 存活率
            2.3.3 過表達(dá)株系中OsHsp40和OsRST1的表達(dá)量分析
    3 討論
全文結(jié)論和創(chuàng)新之處
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ
附錄Ⅱ
致謝
學(xué)術(shù)成果目錄



本文編號：3747206