木薯塊根富含淀粉,是熱帶及亞熱帶地區(qū)重要的糧食作物,同時木薯淀粉在工業(yè)上具有廣泛的用途。淀粉粒的大小是影響淀粉特性及其工業(yè)應(yīng)用的重要因素。淀粉體是植物貯藏器官合成及積累淀粉粒的場所,淀粉粒的大小與淀粉體的體積密切相關(guān)。淀粉體與葉綠體都由前質(zhì)體發(fā)育而成,它們的分裂與增殖都是在質(zhì)體分裂相關(guān)蛋白的精確調(diào)控下完成的,這些蛋白表達量的改變將會干擾質(zhì)體的正常分裂,形成較大的質(zhì)體。FtsZ 蛋白(Filamenting temperature-sensitive mutantZ)可以在質(zhì)體分裂位點聚集形成FtsZ環(huán)(Z環(huán))為質(zhì)體的分裂提供動力,FtsZ是質(zhì)體分裂的關(guān)鍵基因。本實驗室前期已經(jīng)從木薯基因組中克隆獲得3個FtsZ基因(MeFtsZ1、MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2),并發(fā)現(xiàn)它們的表達與木薯塊根淀粉的積累有關(guān)。本研究將木薯3個MeFtsZ基因在擬南芥植株中表達,以探討MeFtsZ基因在木薯質(zhì)體分裂過程中的作用;同時利用塊根特異啟動子,在木薯塊根中對MeFtsZ1基因進行過量表達和反義抑制,為最終實現(xiàn)木薯淀粉體及淀粉粒的基因工程遺傳改良奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.將3個MeFtsZ...

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 植物質(zhì)體分裂研究進展
        1.1.1 質(zhì)體的起源
        1.1.2 質(zhì)體分裂機制
        1.1.3 質(zhì)體分裂相關(guān)蛋白的研究
    1.2 FtsZ基因的研究進展
        1.2.1 FtsZ基因及其特征
        1.2.2 FtsZ蛋白與其他蛋白之間的相互作用
        1.2.3 FtsZ蛋白與淀粉品質(zhì)改良的相關(guān)性
    1.3 木薯及其淀粉的研究進展
        1.3.1 關(guān)于木薯
        1.3.2 木薯淀粉的經(jīng)濟價值
        1.3.3 木薯淀粉品質(zhì)改良的研究進展
    1.4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其在木薯育種中的應(yīng)用
    1.5 本研究的目的與意義
    1.6 技術(shù)路線
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗試劑與材料
        2.1.1 主要儀器
        2.1.2 植物實驗材料
        2.1.3 載體與菌株
    2.2 木薯FtsZ基因融合GFP基因植物表達載體的構(gòu)建
        2.2.1 引物設(shè)計
        2.2.2 PCR擴增MeFtsZ基因
        2.2.3 PCR產(chǎn)物的純化
        2.2.4 基因及載體的雙酶切
        2.2.5 酶切產(chǎn)物的回收
        2.2.6 基因與植物表達載體連接
        2.2.7 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.2.8 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞
        2.2.9 菌液PCR篩選陽性克隆及測序分析
        2.2.10 質(zhì)粒的提取
        2.2.11 質(zhì)粒的PCR及酶切驗證
    2.3 表達載體轉(zhuǎn)化LBA4404根癌農(nóng)桿菌
        2.3.1 LBA4404根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備
        2.3.2 植物表達載體轉(zhuǎn)化LBA4404根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞
        2.3.3 重組農(nóng)桿菌的篩選與鑒定
    2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化
        2.4.1 擬南芥種子的無菌種植
        2.4.2 擬南芥的轉(zhuǎn)化
        2.4.3 擬南芥陽性植株的篩選及移栽
    2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子鑒定
        2.5.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA的小量提取
        2.5.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定
        2.5.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.5.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的RT-PCR鑒定
    2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型鑒定
        2.6.1 擬南芥葉片樹脂半薄切片的制片及電子透射顯微鏡的觀察
        2.6.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠體觀察及數(shù)目統(tǒng)計
    2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥中質(zhì)體分裂相關(guān)基因的表達量分析
    2.8 MeFtsZ1基因的塊根過量表達載體構(gòu)建
        2.8.1 引物設(shè)計
        2.8.2 PCR擴增MeFtsZ1基因
        2.8.3 PCR產(chǎn)物的純化
        2.8.4 MeFtsZ1基因及載體的雙酶切
        2.8.5 酶切產(chǎn)物的回收
        2.8.6 MeFtsZ1基因連接植物表達載體
        2.8.7 菌液PCR篩選陽性克隆、測序
        2.8.8 pVKH-SpoA-MeFtsZ1質(zhì)粒的提取及鑒定
    2.9 MeFtsZ1基因的塊根反義表達載體的構(gòu)建
        2.9.1 引物設(shè)計
        2.9.2 反義片段的PCR擴增
        2.9.3 反義片段的純化
        2.9.4 反義片段及載體的雙酶切
        2.9.5 目的片段的回收、連接及轉(zhuǎn)化
        2.9.6 陽性克隆篩選、測序
        2.9.7 pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1的質(zhì)粒提取、PCR及酶切驗證
    2.10 華南8號木薯的遺傳轉(zhuǎn)化及分子鑒定
        2.10.1 工程菌液的制備
        2.10.2 木薯遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)培養(yǎng)基配制
        2.10.3 木薯體細胞胚的誘導(dǎo)及子葉的形成
        2.10.4 農(nóng)桿菌侵染木薯子葉及植株再生
        2.10.5 轉(zhuǎn)基因木薯組培苗的PCR鑒定
        2.10.6 轉(zhuǎn)基因木薯植株的煉苗、移栽
        2.10.7 轉(zhuǎn)基因木薯的田間種植及樣品采集
        2.10.8 轉(zhuǎn)基因木薯塊根淀粉體觀察
        2.10.9 轉(zhuǎn)基因木薯的質(zhì)體分裂相關(guān)基因表達分析
        2.10.10 轉(zhuǎn)基因木薯的Soutern-blot分析
    2.11 轉(zhuǎn)基因木薯塊根淀粉合成關(guān)鍵酶(AGPase,GBSS,SSS,SBE)的酶活性分析
        2.11.1 塊根粗酶液的制備
        2.11.2 AGPase的酶活性分析
        2.11.3 GBSS和SSS的酶活性分析
        2.11.4 SBE的酶活性分析
    2.12 轉(zhuǎn)基因木薯塊根淀粉特性分析
        2.12.1 木薯塊根淀粉的提取
        2.12.2 淀粉特性分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 植物表達載體MeFtsZ1-GFP、MeFtsZ2-1-GFP相MeFtsZ2-2-GFP的構(gòu)建
    3.2 木薯FtsZ基因在擬南芥質(zhì)體分裂中的作用
        3.2.1 FtsZ基因在擬南芥中的轉(zhuǎn)化
        3.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組DNA提取
        3.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定
        3.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA的提取
        3.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的RT-PCR鑒定
        3.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察
        3.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥中葉綠體數(shù)目及葉綠素的變化
        3.2.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥中質(zhì)體分裂相關(guān)基因的表達量分析
    3.3 MeFtsZ1基因在木薯塊根的過量表達及反義抑制
        3.3.1 MeFtsZ1基因的塊根過量表達載體的構(gòu)建
        3.3.2 MeFtsZ1基因的塊根反義表達載體的構(gòu)建
        3.3.3 木薯的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因木薯的基因組DNA提取
        3.3.5 木薯轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
        3.3.6 轉(zhuǎn)基因木薯組培苗的煉苗及移栽
        3.3.7 轉(zhuǎn)基因木薯的淀粉體觀察
        3.3.8 MeFtsZ1在轉(zhuǎn)基因木薯的表達及質(zhì)體分裂相關(guān)基因的表達分析
        3.3.9 轉(zhuǎn)基因木薯的Soutern-blot分析
    3.4 轉(zhuǎn)基因木薯的田間生長測定
        3.4.0 株高的測定
        3.4.1 葉長的測定
        3.4.2 葉寬的測定
        3.4.3 葉柄長的測定
        3.4.4 葉片數(shù)的統(tǒng)計
        3.4.5 莖粗的測定
        3.4.6 塊根長度的測定
        3.4.7 塊根直徑的測定
    3.5 轉(zhuǎn)基因木薯的淀粉合成相關(guān)酶分析
    3.6 產(chǎn)量性狀分析
    3.7 轉(zhuǎn)基因木薯的淀粉特性分析
        3.7.1 淀粉體觀察及淀粉粒度分析
        3.7.2 淀粉粘度分析
        3.7.3 淀粉熱特性分析
4 討論
    4.1 MeFtsZ蛋白定位于葉片中的葉綠體上
    4.2 轉(zhuǎn)MeFtsZ基因影響擬南芥葉綠體的分裂
    4.3 MeFtsZ1基因參與木薯塊根淀粉體的分裂
    4.4 木薯淀粉體分裂與淀粉粒大小、形態(tài)的關(guān)系
    4.5 轉(zhuǎn)MeFtsZ1基因?qū)δ臼砩L及產(chǎn)量的影響
    4.6 木薯淀粉粒大小對淀粉粘度特性的影響
    4.7 木薯淀粉粒大小對淀粉熱特性的影響
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介



本文編號：3745818