水稻是世界上主要的糧食作物之一。蟲害是造成水稻產(chǎn)量損失的主要原因之一。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）、二化螟（Chilo suppressalis）和三化螟（Tryporyza incertulas）是水稻生產(chǎn)中主要的鱗翅目害蟲。已有大量研究報道轉(zhuǎn)Bt基因水稻可以有效的控制鱗翅目害蟲。目前培育的轉(zhuǎn)基因水稻大多帶有篩選標(biāo)記基因,而篩選標(biāo)記的存在會帶來諸多不利影響。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙質(zhì)粒雙菌株法將cry1C*基因、cry2A*基因分別與hpt基因一起轉(zhuǎn)化優(yōu)良秈稻恢復(fù)系明恢86（MH86）,然后通過轉(zhuǎn)基因植株的自交分離分別獲得無標(biāo)記的cry1C*與cry2A抗鱗翅目害蟲水稻。除此以外,鞘翅目的稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）是田間危害水稻的又一類害蟲。有研究報道Cry3類Bt蛋白對鞘翅目昆蟲有毒殺作用,本研究把人工優(yōu)化合成的cry3Aa*與cry3Bb*分別轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11（ZH11）,期望培育出抗鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因水稻。本研究取得的主要結(jié)果如下:1.通過PCR檢測以及SouthernBlotting檢測,在pMF-1C... 

【文章頁數(shù)】：117 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 研究問題的由來
    2 Bt基因簡介
    3 無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的培育策略
        3.1 共轉(zhuǎn)化法
            3.1.1 雙質(zhì)粒雙菌株法
            3.1.2 雙質(zhì)粒單菌株法
            3.1.3 雙T-DNA區(qū)單質(zhì)粒法
        3.2 位點特異性重組法
            3.2.1 Cre/LoxP系統(tǒng)
            3.2.2 FLP/Frt系統(tǒng)
            3.2.3 R/Rs系統(tǒng)
        3.3 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)
        3.4 MAT載體系統(tǒng)
        3.5 同源重組
        3.6 PCR法
    4 抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究進展
        4.1 一個接近商業(yè)化的抗蟲水稻品系:華恢1號
        4.2 轉(zhuǎn)新型Bt基因抗蟲水稻的培育
        4.3 雙價Bt抗蟲水稻的培育
        4.4 組織特異性表達(dá)的Bt抗蟲水稻
    5 抗鞘翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物研究進展
        5.1 對鞘翅目昆蟲有效毒殺的Bt菌株及基因
        5.2 抗鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因植物
            5.2.1 轉(zhuǎn)cry3A類基因的植物
            5.2.2 轉(zhuǎn)cry3B類基因的植物
            5.2.3 其他類抗鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)Bt基因植物
    6 轉(zhuǎn)基因水稻安全性研究現(xiàn)狀
        6.1 食用安全性
        6.2 環(huán)境安全性
            6.2.1 對非靶標(biāo)昆蟲的影響
            6.2.2 Bt水稻對根系生態(tài)系統(tǒng)的影響
        6.3 小結(jié)
    7 本研究的目的與意義
第二章 無標(biāo)記抗鱗翅目害蟲水稻的培育
    1 試驗材料
        1.1 載體與菌株
        1.2 Bt抗蟲基因
        1.3 水稻品種
        1.4 供試?yán)ハx
    2 試驗方法
        2.1 技術(shù)路線
        2.2 無標(biāo)記轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
        2.3 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4 水稻葉片DNA的少量抽提
        2.5 PCR陽性檢測
        2.6 植物總DNA大量抽提
        2.7 Southern Blotting
        2.8 無標(biāo)記純合后代篩選
        2.9 田間雜交
        2.10 Bt蛋白含量測定
            2.10.1 ELISA反應(yīng)(以Cry1C蛋白為例)
            2.10.2 酶標(biāo)儀測定Bt蛋白濃度
        2.11 室內(nèi)接蟲試驗
        2.12 田間抗蟲性試驗
        2.13 農(nóng)藝性狀考查
        2.14 側(cè)翼序列分離
        2.15 回交與雙價聚合材料的后代純合株系篩選
    3 結(jié)果與分析
        3.1 遺傳轉(zhuǎn)化與DNA分子檢測
        3.2 純合株系及相應(yīng)的雜交種中Bt蛋白含量測定
            3.2.1 Cry1C蛋白含量測定
            3.2.2 Cry2A蛋白含量測定
        3.3 轉(zhuǎn)基因材料的室內(nèi)接蟲試驗
            3.3.1 cy1C~*轉(zhuǎn)基因材料室內(nèi)對一齡二化螟及三化螟的抗性
            3.3.2 cry2A~*轉(zhuǎn)基因材料室內(nèi)對一齡二化螟及三化螟的抗性
        3.4 轉(zhuǎn)基因材料的田間抗蟲性
        3.5 轉(zhuǎn)基因材料田間農(nóng)藝性狀考查
        3.6 轉(zhuǎn)基因材料中T-DNA的側(cè)翼序列信息
            3.6.1 株系1CH1-2中T-DNA的側(cè)翼序列信息
            3.6.2 株系8-30中T-DNA的側(cè)翼序列信息
        3.7 回交材料的純合篩選
        3.8 回交材料的田間農(nóng)藝性狀考查
第三章 抗鞘翅目害蟲水稻的培育
    1 試驗材料
        1.1 載體及菌株
        1.2 Bt抗蟲基因
        1.3 水稻材料
        1.4 供試?yán)ハx
    2 試驗方法
        2.1 技術(shù)路線
        2.2 載體構(gòu)建
            2.2.1 雙T-DNA載體的改造
            2.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4 水稻葉片DNA的少量抽提
        2.5 水稻葉片RNA的抽提
        2.6 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.7 PCR檢測
        2.8 T_0代植株的Southern Blotting檢測
        2.9 單拷貝純合株系篩選
        2.10 轉(zhuǎn)基因純合株系室內(nèi)對稻水象甲的抗性測定
            2.10.1 取食斑調(diào)查試驗
            2.10.2 死亡率調(diào)查試驗
                2.10.2.1 分蘗期植株接蟲試驗
                2.10.2.2 幼苗期植株接蟲試驗
        2.11 抗蟲數(shù)據(jù)處理與分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 遺傳轉(zhuǎn)化
        3.2 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blotting檢測
        3.3 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量檢測
            3.3.1 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測
            3.3.2 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測
        3.4 轉(zhuǎn)基因植株的純合株系篩選
        3.5 轉(zhuǎn)基因純合株系對稻水象甲的抗性
            3.5.1 取食斑總數(shù)與累計長度調(diào)查
            3.5.2 轉(zhuǎn)基因植株對稻水象甲成蟲的抗性
第四章 討論
    1 無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因材料的Bt蛋白含量
    2 不同螟蟲對Bt蛋白的敏感性差異
    3 轉(zhuǎn)基因材料的農(nóng)藝性狀
    4 轉(zhuǎn)cry1C~*與cry2A~*無標(biāo)記材料的應(yīng)用前景
    5 無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因材料的優(yōu)點及pDT載體的應(yīng)用
    6 稻水象甲抗性測定方法的思考
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 載體圖
附錄Ⅱ Tail-PCR反應(yīng)體系及程序
附錄Ⅲ 組織培養(yǎng)試劑配制與培養(yǎng)基配方
    2.1 相關(guān)試劑配制
    2.2 秈稻遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
    2.3 粳稻遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
附錄Ⅳ 個人簡介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)Bt水稻土壤跳蟲群落組成及其數(shù)量變化[J]. 祝向鈺,李志毅,常亮,袁一揚,戈峰,吳剛,陳法軍.  生態(tài)學(xué)報. 2012(11)
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[3]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)mBt886Cry3Aa轉(zhuǎn)化菊花及對菊天牛毒殺作用[J]. 王沛,周洲,蘇麗娟,尹新明.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(14)
[4]兩株殺鞘翅目害蟲Bt菌株的生物活性及殺蟲蛋白基因鑒定[J]. 初立良,鄭桂玲,周洪旭,李長友,李國勛.  華北農(nóng)學(xué)報. 2010(03)
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博士論文
[1]Bt抗蟲水稻的培育[D]. 唐微.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[2]三種Bt基因（cry1Ac、cry2A～*和cry9C～*）抗蟲水稻的培育及評價[D]. 陳浩.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005

碩士論文
[1]發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Bt基因Cry8e轉(zhuǎn)化大豆抗蠐螬研究[D]. 劉艷菊.河南師范大學(xué) 2010
[2]轉(zhuǎn)抗蟲基因（BtCry3A）741楊抗蟲性研究[D]. 李靜.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[3]抗鞘翅目Bt殺蟲基因GFMcry3Bb的人工合成、原核表達(dá)及植物轉(zhuǎn)基因的研究[D]. 陳孝平.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004
[4]Bt殺蟲基因雙價植物表達(dá)載體的構(gòu)建及抗蟲馬鈴薯植株的獲得[D]. 蔣紅玲.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2001



本文編號：3729478