水稻是世界上主要的糧食作物之一。蟲害是造成水稻產(chǎn)量損失的主要原因之一。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）、二化螟（Chilo suppressalis）和三化螟（Tryporyza incertulas）是水稻生產(chǎn)中主要的鱗翅目害蟲。已有大量研究報(bào)道轉(zhuǎn)Bt基因水稻可以有效的控制鱗翅目害蟲。目前培育的轉(zhuǎn)基因水稻大多帶有篩選標(biāo)記基因,而篩選標(biāo)記的存在會(huì)帶來(lái)諸多不利影響。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙質(zhì)粒雙菌株法將cry1C*基因、cry2A*基因分別與hpt基因一起轉(zhuǎn)化優(yōu)良秈稻恢復(fù)系明恢86（MH86）,然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株的自交分離分別獲得無(wú)標(biāo)記的cry1C*與cry2A抗鱗翅目害蟲水稻。除此以外,鞘翅目的稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）是田間危害水稻的又一類害蟲。有研究報(bào)道Cry3類Bt蛋白對(duì)鞘翅目昆蟲有毒殺作用,本研究把人工優(yōu)化合成的cry3Aa*與cry3Bb*分別轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11（ZH11）,期望培育出抗鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因水稻。本研究取得的主要結(jié)果如下:1.通過(guò)PCR檢測(cè)以及SouthernBlotting檢測(cè),在pMF-1C... 

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 研究問(wèn)題的由來(lái)
    2 Bt基因簡(jiǎn)介
    3 無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的培育策略
        3.1 共轉(zhuǎn)化法
            3.1.1 雙質(zhì)粒雙菌株法
            3.1.2 雙質(zhì)粒單菌株法
            3.1.3 雙T-DNA區(qū)單質(zhì)粒法
        3.2 位點(diǎn)特異性重組法
            3.2.1 Cre/LoxP系統(tǒng)
            3.2.2 FLP/Frt系統(tǒng)
            3.2.3 R/Rs系統(tǒng)
        3.3 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)
        3.4 MAT載體系統(tǒng)
        3.5 同源重組
        3.6 PCR法
    4 抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因水稻研究進(jìn)展
        4.1 一個(gè)接近商業(yè)化的抗蟲水稻品系:華恢1號(hào)
        4.2 轉(zhuǎn)新型Bt基因抗蟲水稻的培育
        4.3 雙價(jià)Bt抗蟲水稻的培育
        4.4 組織特異性表達(dá)的Bt抗蟲水稻
    5 抗鞘翅目害蟲轉(zhuǎn)基因植物研究進(jìn)展
        5.1 對(duì)鞘翅目昆蟲有效毒殺的Bt菌株及基因
        5.2 抗鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因植物
            5.2.1 轉(zhuǎn)cry3A類基因的植物
            5.2.2 轉(zhuǎn)cry3B類基因的植物
            5.2.3 其他類抗鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)Bt基因植物
    6 轉(zhuǎn)基因水稻安全性研究現(xiàn)狀
        6.1 食用安全性
        6.2 環(huán)境安全性
            6.2.1 對(duì)非靶標(biāo)昆蟲的影響
            6.2.2 Bt水稻對(duì)根系生態(tài)系統(tǒng)的影響
        6.3 小結(jié)
    7 本研究的目的與意義
第二章 無(wú)標(biāo)記抗鱗翅目害蟲水稻的培育
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 載體與菌株
        1.2 Bt抗蟲基因
        1.3 水稻品種
        1.4 供試?yán)ハx
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 技術(shù)路線
        2.2 無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
        2.3 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4 水稻葉片DNA的少量抽提
        2.5 PCR陽(yáng)性檢測(cè)
        2.6 植物總DNA大量抽提
        2.7 Southern Blotting
        2.8 無(wú)標(biāo)記純合后代篩選
        2.9 田間雜交
        2.10 Bt蛋白含量測(cè)定
            2.10.1 ELISA反應(yīng)(以Cry1C蛋白為例)
            2.10.2 酶標(biāo)儀測(cè)定Bt蛋白濃度
        2.11 室內(nèi)接蟲試驗(yàn)
        2.12 田間抗蟲性試驗(yàn)
        2.13 農(nóng)藝性狀考查
        2.14 側(cè)翼序列分離
        2.15 回交與雙價(jià)聚合材料的后代純合株系篩選
    3 結(jié)果與分析
        3.1 遺傳轉(zhuǎn)化與DNA分子檢測(cè)
        3.2 純合株系及相應(yīng)的雜交種中Bt蛋白含量測(cè)定
            3.2.1 Cry1C蛋白含量測(cè)定
            3.2.2 Cry2A蛋白含量測(cè)定
        3.3 轉(zhuǎn)基因材料的室內(nèi)接蟲試驗(yàn)
            3.3.1 cy1C~*轉(zhuǎn)基因材料室內(nèi)對(duì)一齡二化螟及三化螟的抗性
            3.3.2 cry2A~*轉(zhuǎn)基因材料室內(nèi)對(duì)一齡二化螟及三化螟的抗性
        3.4 轉(zhuǎn)基因材料的田間抗蟲性
        3.5 轉(zhuǎn)基因材料田間農(nóng)藝性狀考查
        3.6 轉(zhuǎn)基因材料中T-DNA的側(cè)翼序列信息
            3.6.1 株系1CH1-2中T-DNA的側(cè)翼序列信息
            3.6.2 株系8-30中T-DNA的側(cè)翼序列信息
        3.7 回交材料的純合篩選
        3.8 回交材料的田間農(nóng)藝性狀考查
第三章 抗鞘翅目害蟲水稻的培育
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 載體及菌株
        1.2 Bt抗蟲基因
        1.3 水稻材料
        1.4 供試?yán)ハx
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 技術(shù)路線
        2.2 載體構(gòu)建
            2.2.1 雙T-DNA載體的改造
            2.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3 遺傳轉(zhuǎn)化
        2.4 水稻葉片DNA的少量抽提
        2.5 水稻葉片RNA的抽提
        2.6 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.7 PCR檢測(cè)
        2.8 T_0代植株的Southern Blotting檢測(cè)
        2.9 單拷貝純合株系篩選
        2.10 轉(zhuǎn)基因純合株系室內(nèi)對(duì)稻水象甲的抗性測(cè)定
            2.10.1 取食斑調(diào)查試驗(yàn)
            2.10.2 死亡率調(diào)查試驗(yàn)
                2.10.2.1 分蘗期植株接蟲試驗(yàn)
                2.10.2.2 幼苗期植株接蟲試驗(yàn)
        2.11 抗蟲數(shù)據(jù)處理與分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 遺傳轉(zhuǎn)化
        3.2 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blotting檢測(cè)
        3.3 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量檢測(cè)
            3.3.1 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測(cè)
            3.3.2 T_0代轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè)
        3.4 轉(zhuǎn)基因植株的純合株系篩選
        3.5 轉(zhuǎn)基因純合株系對(duì)稻水象甲的抗性
            3.5.1 取食斑總數(shù)與累計(jì)長(zhǎng)度調(diào)查
            3.5.2 轉(zhuǎn)基因植株對(duì)稻水象甲成蟲的抗性
第四章 討論
    1 無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因材料的Bt蛋白含量
    2 不同螟蟲對(duì)Bt蛋白的敏感性差異
    3 轉(zhuǎn)基因材料的農(nóng)藝性狀
    4 轉(zhuǎn)cry1C~*與cry2A~*無(wú)標(biāo)記材料的應(yīng)用前景
    5 無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因材料的優(yōu)點(diǎn)及pDT載體的應(yīng)用
    6 稻水象甲抗性測(cè)定方法的思考
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 載體圖
附錄Ⅱ Tail-PCR反應(yīng)體系及程序
附錄Ⅲ 組織培養(yǎng)試劑配制與培養(yǎng)基配方
    2.1 相關(guān)試劑配制
    2.2 秈稻遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
    2.3 粳稻遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方
附錄Ⅳ 個(gè)人簡(jiǎn)介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)Bt水稻土壤跳蟲群落組成及其數(shù)量變化[J]. 祝向鈺,李志毅,常亮,袁一揚(yáng),戈峰,吳剛,陳法軍.  生態(tài)學(xué)報(bào). 2012(11)
[2]連續(xù)回交對(duì)消除農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化引起水稻體細(xì)胞變異的影響[J]. 楊宙,陳浩,唐微,林擁軍.  作物學(xué)報(bào). 2012(05)
[3]根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)mBt886Cry3Aa轉(zhuǎn)化菊花及對(duì)菊天牛毒殺作用[J]. 王沛,周洲,蘇麗娟,尹新明.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(14)
[4]兩株殺鞘翅目害蟲Bt菌株的生物活性及殺蟲蛋白基因鑒定[J]. 初立良,鄭桂玲,周洪旭,李長(zhǎng)友,李國(guó)勛.  華北農(nóng)學(xué)報(bào). 2010(03)
[5]轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)進(jìn)展[J]. 朱禎.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào). 2010(02)
[6]Development of Marker-Free Transgenic Cry1Ab Rice with Lepidopteran Pest Resistance by Agrobacterium Mixture-Mediated Co-transformation[J]. QI Yong-bin1, 2, YE Sheng-hai1, LU Yan-ting1, JIN Qing-sheng1, ZHANG Xiao-ming1 (1Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 2Biotechnology Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China).  Rice Science. 2009(03)
[7]Rapid Generation of Selectable Marker-Free Transgenic Rice with Three Target Genes by Co-Transformation and Anther Culture[J]. ZHU Li1, FU Ya-ping1, LIU Wen-zhen1, HU Guo-cheng1, SI Hua-min1, TANG Ke-xuan2, SUN Zong-xiu1 (1 State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China; 2 Plant Biotechnology Research Center, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030, China; These authors contributed equally to this paper).  Rice Science. 2007(04)
[8]利用雙T-DNA載體系統(tǒng)培育無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因大豆[J]. 張秀春,彭明,吳坤鑫,郭麗瓊,林俊揚(yáng),林俊芳.  大豆科學(xué). 2006(04)
[9]轉(zhuǎn)抗鞘翅目害蟲基因銀腺楊的獲得及其抗蟲性的初步研究[J]. 張冰玉,蘇曉華,李義良,張永安,曲良建,王玉珠,田穎川.  北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2006(02)
[10]T03對(duì)稻水象甲的抗性測(cè)定[J]. 田春暉,于鳳泉,劉培斌,李志強(qiáng),孫富余.  遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué). 2003(05)

博士論文
[1]Bt抗蟲水稻的培育[D]. 唐微.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[2]三種Bt基因（cry1Ac、cry2A～*和cry9C～*）抗蟲水稻的培育及評(píng)價(jià)[D]. 陳浩.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005

碩士論文
[1]發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Bt基因Cry8e轉(zhuǎn)化大豆抗蠐螬研究[D]. 劉艷菊.河南師范大學(xué) 2010
[2]轉(zhuǎn)抗蟲基因（BtCry3A）741楊抗蟲性研究[D]. 李靜.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[3]抗鞘翅目Bt殺蟲基因GFMcry3Bb的人工合成、原核表達(dá)及植物轉(zhuǎn)基因的研究[D]. 陳孝平.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004
[4]Bt殺蟲基因雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建及抗蟲馬鈴薯植株的獲得[D]. 蔣紅玲.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2001



本文編號(hào)：3729478